Ex-vivo Generierung von neutrophilen Zellen zur Prävention und Therapie der Sepsis

Abstract

Neutrophile Granulozyten stellen das zentrale Element der angeborenen Immunität gegen mikrobielle Infektionen des Körpers dar. Ein Versagen dieses Systems führt zu systemischen Infektionen, begleitet von der lebensbedrohlichen Sepsis-Symptomatik. Im Rahmen der Arbeit wurden Strategien und Systeme für Kultivierungsprozesse zur zelltherapeutischen Prävention und Therapie der Sepsis erarbeitet. Mit dem hier entwickelten Mini-Spinner-System ist es erstmals möglich, Zellinien und primäre Zellen unter kontrollierten Bedingungen mehrfach parallel in Volumina von 20 bis 50 mL zu kultivieren. Damit konnte ein kliniktaugliches Verfahren entwi-ckelt werden, um ausgehend von CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut neutrophil differenzierte Zellen ex-vivo zu generieren. Dabei wurden die Zusammensetzung des Mediums, der Wachstumsfaktoren sowie relevante Umgebungsbedin-gungen wie Temperatur, pH- und pO2-Wert optimiert. Bereits nach 10 Tagen Kultivierung erreichten die neutrophilen Zellen einen Anteil von > 75% der Gesamtzellpopulation. An Tag 16 konnten auch Zellen mit der charakteristischen segmentkernigen Morphologie sowie Phagozytose- und Oxidative-Burst-Funktionalität reifer neutrophiler Granulozyten nachgewiesen werden. Mit einem in dieser Arbeit entwickelten scale-up-fähigen Verfahren zur Vermehrung und Ausreifung der Zellinie HL-60 können ebenfalls Zellen mit granulozytärer Funktionalität in großen Mengen und damit zu vertretbaren Kosten hergestellt werden. Die generierten Zellen sind lagerfähig womit sich dieser Ansatz besonders für die Therapie der akuten Sepsis eignet. Im ersten Schritt wurden relevante Verfahrensparameter (Medium, Supplementierung, Umgebungs-parameter, Fütterung) zur Generierung von HL-60-Biomasse optimiert. Die ATRA-induzierte Reifung von HL60 erfolgt in einem Intervall von 22,5 bis 48 h und ATRA-Konzentratione von 30 bis 50µM. <br /> Beide Verfahren zur ex-vivo Generierung von neutrophilen Granulozyten erlauben die Herstel-lung von neutrophilen Zelltypen zur zellbasierten Prävention und Therapie der Sepsis und stellen Alternativen zur Verwendung von Granulozytenkonzentraten aus adulten Spendern.

<b>Ex-vivo generation of neutrophilic cells for prevention and therapy of sepsis</b><br /> Neutrophil granulocytes represent the key element of native immunity against microbial infection. Failure of this system leads to a whole body infection and as a consequence thereof to life-threatening symptoms of sepsis. In this work strategies and systems were developed for cell based prevention and therapy of sepsis. The developed Mini-Spinner system allows for the first time the multi-parallel cultivation of both cell lines and primary cells under fully controlled conditions in volumes of 20 to 50 mL. Using this system a clinically applicable cultivation process for the ex-vivo generation of neutrophil granulocytes starting from hematopoeietic stem and progenitor cells was developed. Medium composition, growth factor combination as well as relevant ambient conditions like temperature, pH and pO₂ were optimized. The proportion of neutrophil cell types exceeded 75% of total cell count by day 10. At day 16 cells showed the typical banded and segmented morphology as well as phagocytosis and oxidative-burst activity which are typical for mature neutrohil granulocytes. In this thesis a scalable process for the production and maturation of HL-60 cells was developed allowing cost-effective production of cells with neutrophil functionality in large quantities. This might be useful for the therapy of acute septic events as the generated cells can be stored until needed. In a first step relevant process parameters (medium, supplements, ambient parameters, feeding) were optimized for the expansion of HL-60 biomass. Maturation of HL-60 is induced using ATRA at concentrations from 30 to 50 µM during a time-span of 22.5 to 48 h. Both processes allow the ex-vivo generation of neutrophil granulocytes for cell-based prevention ant therapy of sepsis and might be reasonable alternatives for the usage of donor-granulocytes.