Allosterische Modulation der Pilocarpin-induzierten G Protein-Aktivierung am muskarinischen M₂- und M₄-Acetylcholin-Rezeptor

Abstract

In einer vorangegangenen Arbeit war gezeigt worden, dass der allosterische Modulator Alcuronium an muscarinischen M₂-Rezeptoren die intrinsische Aktivität des Partialagonisten Pilocarpin zu senken vermag. In der vorliegenden Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob eine allosterische Modulation der intrinsischen Aktivität auch durch andere allosterische Modulatoren und an anderen Subtypen der Muskarinrezeptoren möglich ist. <br /> Die Messung der Pilocarpin-induzierten G Protein-Aktivierung erfolgte anhand der quantitativen Bestimmung der [³⁵S]GTPγS-Bindung und erlaubte Rückschlüsse auf die Veränderung der Pilocarpin-Wirksamkeit ("potency") und seiner intrinsischen Aktivität durch allosterische Modulatoren. Es wurden strukturell unterschiedliche, zu den Substanzklassen der Caracurine, Strychnin-Derivate und Alkan-bis-Ammonium-Verbindungen gehörende allosterische Modulatoren, die "Prototyp-Modulatoren" Alcuronium und Gallamin sowie der "atypisch" wirksame Modulator Duo3 eingesetzt. Die Experimente wurden an Membranen aus CHO-Zellen durchgeführt, die muskarinische Rezeptoren vom M₂- bzw. M₄-Subtyp stabil überexprimierten. <br /> Die allosterischen Modulatoren senkten die intrinsische Aktivität von Pilocarpin an M₂-Rezeptoren konzentrationsabhängig und in unterschiedlichem Ausmaß. Der allosterische Einfluss auf die Wirksamkeit variierte: es fanden sich Förderer der Pilocarpin-Bindung (Naphmethonium), Substanzen, die die Pilocarpin-Bindung unbeeinflusst ließen (Alcuronium, Di-Strychnin 6, MM7a) sowie allosterische Verminderer der Pilocarpin-Bindung (alle weiteren Substanzen). Analoge Ergebnisse wurden mit den Substanzen Alcuronium, W84, Naphmethonium und Gallamin am M4-Rezeptor erhoben. Es konnte gezeigt werden, dass die allosterische Verminderung der intrinsischen Aktivität in einem Konzentrationsbereich erfolgt, in dem sich ternäre Komplexe zwischen Rezeptor, Pilocarpin und Alloster bilden. Offenbar ist die Rezeptorkonformation im ternären Komplex eine weniger aktive als in dem binären Komplex aus Rezeptor und Pilocarpin. <br /> Die Kooperativitätsfaktoren der Allostere mit Pilocarpin einerseits und mit dem muskarinischen Antagonisten <i>N</i>Methylscopolamin (NMS) andererseits, die die Affinitätsverschiebung dieser Liganden durch die Bindung der allosterischen Modulatoren an Pilocarpin- bzw. an NMS-besetzten M₂-Rezeptoren angeben, korrelieren miteinander. Substanzen mit einer hohen Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor haben also auch eine relativ hohe Affinität zum Pilocarpin-besetzten Rezeptor. Offenbar nimmt die Bindungsstelle der allosterischen Modulatoren am Pilocarpin- und am NMS-besetzten M₂-Rezeptorprotein eine ähnliche räumliche Orientierung ein. <br /> Der Einfluss der allosterischen Modulatoren auf die Wirksamkeit wie auch auf die intrinsische Aktivität von Pilocarpin ist am M₂- und am M₄-Rezeptor gleicher Art, mit einer höheren Bindungsaffinität der allosterischen Modulatoren für den M₂-Subtyp. Die Modulierbarkeit der intrinsischen Aktivität von Pilocarpin ist also nicht auf den M₂-Subtyp begrenzt. Die ähnlichen Ergebnisse an M₂- und M₄-Rezeptorproteinen lassen darauf schließen, dass die allosterischen Modulatoren mit dem M₂- und am M₄-Rezeptor in analoger Art interagieren.