Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion von DsrN und DsrL im dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel von <i>Allochromatium vinosum</i>

Abstract

Die im <i>dsr</i>-Operon kodierten Proteine des phototrophen Schwefelbakteriums <i>Allochromatium vinosum</i> sind in die Oxidation akkumulierten Schwefels involviert. Zwei dieser Proteine, DsrN und DsrL, wurden in dieser Arbeit näher charakterisiert. Aus pho-tolithoautotroph angezogenen <i>A. vinosum</i>-Zellen und auch aus dem Enzym Sulfitreduktase (DsrAB) wurde das Tetrapyrrol Siro(häm)amid isoliert. Dies zeigt, dass Siro(häm)amid die prosthetische Gruppe der reversen dissimilatorischen Sulfitreduktase in <i>A. vinosum</i> ist. Dieser Nachweis bestätigt die aufgrund von Sequenzhomologien postulierte Funktion von DsrN als Sirohäm-Amidase. Eine "in frame"-Deletion von <i>dsrN</i> führt zu einer signifikant verlangsamten Schwefeloxidation, die durch Komplementation mit <i>dsrN</i> wieder aufgehoben werden kann. DsrN ist folglich für die Schwefeloxidation in <i>A. vinosum</i> nicht essentiell, aber für eine effiziente Oxidationsreaktion notwendig. Spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Sulfitreduktase der Mutante Sirohäm enthält. Die fehlende Amidgruppe der prosthetischen Gruppe führt wahrscheinlich zu einer geringeren Aktivität der Sulfitreduktase und damit zu der beobachteten verlangsamten Schwefeloxidation der Mutante. Das <i>dsrN</i>-Gen ist sowohl in Sulfat/Sulfitreduzierern als auch in Schwefeloxidierern weit verbreitet. Dies deutet auf eine wichtige Funktion des Proteins im dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel hin und lässt vermuten, dass in den meisten, wenn nicht allen am Energiestoffwechsel beteiligten Sulfitreduktasen, Siro(häm)amid die prosthetische Gruppe ist. <br /> Das DsrL-Protein konnte rekombinant aus <i>E. coli</i> aufgereinigt werden. Es bildet verschiedene Multimere und enthält 1 Mol FAD pro Mol DsrL-Monomer, die vermuteten Eisen-Schwefel-Cluster konnten nicht detektiert werden. Die für DsrL postulierte Glutamatsynthaseaktivität konnte nicht bestätigt werden. Sowohl für das rekombinante als auch für das native DsrL aus <i>A. vinosum</i> konnte jedoch über den Nachweis der Diaphoraseaktivität eine Funktion als elektronentransportierendes Enzym mit NADH als Elektronendonor gezeigt werden. Natives DsrL wurde zusammen mit der Sulfitreduktase aus <i>A. vinosum</i> aufgereinigt. Die Proteine bilden einen DsrA₂B₂L₂-Komplex, der sowohl nach Gelfiltration als auch nach Auftrennung über native Polyacrylamidgelelektrophorese stabil ist. Freies DsrL aus <i>A. vinosum</i> liegt als Homodimer vor. Die "in frame"-Deletion des <i>dsrL</i>-Gens führt zu einer kompletten Hemmung der Schwefeloxidation, die durch Komplementation mit <i>dsrL</i> wieder aufgehoben werden kann. DsrL ist demnach essentiell für die Oxidation akkumulierten Schwefels. Da DsrL bisher nur in schwefeloxidierenden Bakterien nachgewiesen werden konnte, wird eine essentielle Funktion des Proteins in Zusammenhang mit der umgekehrten Sulfitreduktasereaktion vermutet. In Verbin-dung mit den erhaltenen Ergebnissen konnte damit ein neues Modell zur Funktion von DsrL im oxidativen Schwefelstoffwechsel von <i>A. vinosum</i> erstellt werden.