Identifizierung des physiologischen Substrates und funktionelle Charakterisierung des organischen Kationentransporters OCTN1 mittels LC-MS/MS

Abstract

OCTN1 (Novel Organic Cation Transporter) gehört zur so genannten SLC22 Genfamilie (Solute Carrier). Variationen des OCTN1h Gens (SLC22A4) sind mit chronisch entzündlichen Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis und Morbus Crohn assoziiert worden. Die funktionelle Charakterisierung von OCTN1 weist ihn als polyspezifischen pH-sensitiven Transporter organischer Kationen aus, dem bislang kein spezifisches Substrat zu Grunde liegt. <br /> Ziel dieser Arbeit war es, das Substratspektrum von OCTN1 genauer zu untersuchen. Für die Substratsuche wurde eine neue Strategie eingesetzt. OCTN1h wurde in einem konditionellen Expressionssystem in HEK-293-Zellen funktionell zur Expression gebracht. Diese Zellen wurden mit einer biologischen Matrix in der Hoffnung inkubiert, dass sich in diesem komplexen Stoffgemisch eine Substanz befindet, die vom Transporter als Substrat akzeptiert wird und sich in den Zellen anreichert. Eine Screening-Technik mittels LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) wurde entwickelt, um biologische Substrate im Zelllysat zu identifizieren. <br /> Als erstes wurde das Betain der Aminosäure Prolin (Stachydrin) als neues Substrat entdeckt, das dann als Leitstruktur fungierte. Analysen der Transporteffizienzen anderer Aminosäurebetainderivate führten letztendlich zur Identifizierung des physiologischen Substrates. OCTN1 ist ein selektiver und effizienter Ergothioneintransporter. Ergothionein wird von OCTN1h mehr als hundertfach effizienter transportiert (176 microl/min*mg Protein) als die bisher postulierten Substrate Tetraethylammonium und Carnitin und hat eine um den Faktor 20 höhere Affinität (21 micromol/l). OCTN1 nicht exprimierende Zellen sind nahezu impermeabel für Ergothionein. Darüber hinaus akzeptiert der nächstverwandte Transporter OCTN2 Ergothionein praktisch nicht als Substrat. Für den Ergothioneintransport über OCTN1 wird der ins Zellinnere gerichtete Natriumionengradient als Triebkraft ausgenutzt. Zellen, die OCTN1 exprimieren, sind daraufA ausgerichtet, Ergothionein in großen Mengen zu akkumulieren. Ein spezifischerer Name für OCTN1 wäre daher ETT = Ergothionein Transporter.<br /> Ergothionein ist das Betain des 2-Thiolhistidins. Es wird nur von Pilzen und einigen Mykobakterien gebildet. In den menschlichen Organismus gelangt es ausschließlich über die Nahrung, seine eigentliche Funktion ist ungeklärt. Es werden ihm antioxidative Eigenschaften zugeschrieben. <br /> Ein Real-Time-PCR Expressionsprofil zeigte für ETTh eine hohe Expression auf CD71+ Erythrozytenvorläuferzellen, während zirkulierende Erythrozyten den Transporter kaum noch exprimieren. Auf der anderen Seite ist auch die Ergothioneinkonzentration in Erythrozyten erheblich. Dies führte zur Annahme, dass Ergothionein eine bestimmte Aufgabe in den Erythrozyten erfüllt, da sie während ihrer Reifung im Knochenmark mit der Substanz beladen werden. <br /> Von immunologischen Zellen wird ETTh vor allem auf CD14+ Monozyten exprimiert, die auch vergleichsweise hohe Ergothioneingehalte aufweisen. Da genetische Polymorphismen des Transporters mit chronisch entzündlichen Erkrankungen assoziiert worden sind, liegt ein Zusammenhang des Pathomechanismus dieser Erkrankungen mit der Funktion des Ergothioneins nahe. Bisher ist allerdings noch nicht geklärt, welche Rolle das Ergothionein in den Monozyten genau spielt und wie es an immunologischen Prozessen beteiligt sein könnte.