Identifikation epigenetisch regulierter Gene in Gliomen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung de novo methylierter Gene auf die Entstehung von Gliomen untersucht. Gliome sind die häufigsten intrakranialen Neoplasien beim Menschen. Mit einer Inzidenz von 7 Fällen pro 100.000 Einwohnern machen sie über 60% aller Hirntumore aus. Aufgrund ihrer Fähigkeit das umliegende gesunde Gewebe zu infiltrieren, stellt die neurochirurgische Entfernung dieser Tumoren keinen befriedigenden Therapieansatz dar. In den letzten Jahren konnten viele strukturell-genomische Aberrationen und größere chromosomale Bereiche die maßgeblich an der Tumorentstehung und Progession beteiligt sind, identifiziert werden. Dennoch sind die Identität und die Mechanismen der Regulation der Gene, die in Gliomen für diese Fähigkeit verantwortlich sind weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde die de novo Methylierung der DNA niedriggradiger Tumoren mit Hilfe verschiedener Techniken untersucht. Um Kandidatengene zu identifizieren, wurde die DNA von niedriggradigen Tumoren zusammen mit Normalgewebe-DNA auf CpG-Insel Microarrays hybridisiert. Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen führten zu einer Liste von Kandidatengenen, die in niedriggradigen Tumoren methyliert vorliegen. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden ausgewählte Kandidaten mit tumorbiologisch relevanter Funktion näher charakterisiert. Hierzu wurden die identifizierten Kandidatengene Bisulfit-sequenziert um die Methylierung quantitativ erfassen zu können. Für die sequenzierten Tumorgenome wurde mit Hilfe der kompetitiven RT-PCR überprüft, in wieweit die Transkription der Gene von der de novo Methylierung reguliert ist. Für alle untersuchten Gene wurde auf diese Weise eine Reduktion der Transkriptmenge im Tumor festgestellt. Durch die Kultivierung von primären Gliomzellen mit 5-Azacytidin wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass eine Demethylierung des Genoms zur Wiederherstellung der ursprünglichen Transkriptionsmenge bei den untersuchten Genen führte.<br /> Um größere Tumorkollektive schnell und zuverlässig auf den Methylierungszustand von Kandidatengenen untersuchen zu können, wurde das bestehende Protokoll des Methylierungs-Target-Arrays (MTA) dahingehend modifiziert, dass die Signaldetektion statt über eine radioaktive Markierung der DNA durch den Einbau von digUTP stattfindet. Diese modifizierte Form des MTA ermöglicht eine leichtere Handhabung des Untersuchungskollektivs und eine relativ einfach durchzuführende Hybridisierung mit genspezifischen Sonden. <br /> Da viele Gene, die mit Hilfe der DMH identifiziert wurden, an der Zellmotilität beteiligt sind und darüber hinaus die Fähigkeit umgebendes Gewebe zu invadieren charakteristisch für Gliome ist, wurden aus frischen Tumorgewebestücken von Patienten mit einem Glioblastom WHO Grad IV Gliomzellen in Kultur genommen. Diese Zellen ermöglichten weitere in vitro Untersuchungen der Methylierung in frühen Passagen. Um nach charakteristischen Veränderungen der Methylierung, die mit der Fähigkeit zur Migration einhergehen zu suchen, wurde mit den kultivierten Gliomzellen Migrationsassays durchgeführt, die zur Identifikation weiterer Gene die mit dem Erwerb der Migrationsfähigkeit methyliert werden, führte.<br /> Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse führten zu einem tieferen Verständnis der Bedeutung von methylierungsabhängig regulierten Genen in der Entstehung astrozytärer Neoplasien. Ein Teil der Ergebnisse liefert darüber hinaus wichtige Informationen zum Verständnis der Beteiligung methylierter Gene beim Erwerb charakteristischer Eigenschaften von Gliomzellen, wie die ausgeprägte Fähigkeit gesundes Gewebe zu invadieren. Da die heute eingesetzten demethylierenden Chemotherapeutika aufgrund ihres Wirkmechansmus zu starken Nebenwirkungen führen, wurde in dieser Arbeit in Kooperation mit Dr. Frank Lyko (DKFZ, Heidelberg) ein neues, potentielles Chemotherapeutikum auf seine demethylierende Eigenschaften getestet. Zusammen mit den gewonnen Erkenntnissen über die Beteiligung von DNA-Hypermethylierung an der Tumorentstehung verspricht dieser Wirkstoff eine spezifischere Demethylierung von hypermethylierten Genen, als es heute zugelassene Medikamente vermögen.