Reaktionstechnische Untersuchungen zur enzymatischen <i>de novo</i> Synthese von GDP-β-L-Fucose und der <i>in situ</i> Fucosylierung von Oligosacchariden

Abstract

Eine Vielzahl inter- und intrazellul?rer Erkennungsprozesse basieren auf der Wechselwirkung von Oligosacchariden mit anderen (Makro-)Molek?len. Beispiele sind virale oder mikrobielle Infektionen, Entz?ndungsreaktionen und die Fertilisation. In S?ugern ist die Anwesenheit des Monosaccharids und Desoxyzuckers L-Fucose auf den jeweiligen Molek?len entscheidend f?r zahlreiche biologische Prozesse. <i>In vivo</i> wird die enzymatische Synthese fucosylierter Oligosaccharide durch <i>Leloir</i>-Fucosyltransferasen (FucTs) katalysiert. Diese Enzyme ben?tigen den Nucleotidzucker GDP-β-L-Fucose (GDP-Fuc) als Donor. GDP-Fuc ist einer der teuersten und am wenigsten verf?gbaren Nucleotidzucker. Aus diesem Grunde ist die enzymatische <i>in vitro</i> Synthese fucosylierter Verbindungen noch immer schwierig. <br /><b>Zielsetzung</b> Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Verfahren zur enzymatischen Synthese von GDP-Fuc mit den Enzymen des <i>de novo</i> Biosyntheseweges: GDP-α-D-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) und GDP-β-L-Fucose-Synthetase (GFS). Diese beiden Enzyme katalysieren die Synthese von GDP-Fuc ausgehend von GDP-α-D-Mannose (GDP-Man) ?ber die Stufe des Zwischenproduktes GDP-4-keto-6-desoxy-α-D-Mannose (GKDM). Da GDP-Fuc die Aktivit?t der GMD durch eine <i>feedback</i>-Inhibierung stark vermindert, ist bei der Entwicklung von Verfahren zur enzymatischen Synthese von GDP-Fuc die Vermeidung dieser Enzymhemmung unerl?sslich. Durch Erweiterung des Reaktionssystems mit einer α1,2-Fucosyltransferase (α1,2-FucT) wurde dar?ber hinaus das Konzept einer <i>in situ</i> Fucosylierung von Oligosacchariden untersucht. <br /><b>Analytische Methoden & Enzymproduktion</b> Robuste Methoden zur Quantifizierung der relevanten Enzymaktivit?ten wurden entwickelt. Ein Kapillarelektrophorese-Assay zur Verfolgung der GMD-Reaktion wurde dabei durch Anwendung eines genetischen Algorithmus etabliert. Durch Fermentation rekombinanter <i>E. coli</i> St?mme wurden die Enzyme GMD, GFS sowie eine α1,2-FucT aus<i> Helicobacter pylori</i> produziert. Die GMD wurde mit Anionenaustausch-Chromatographie aufgereinigt, die GFS sowie die α1,2-FucT mittels Immobilisierter Metall-Affinit?tschromatographie (IMAC). <br /><b>Enzymkinetik</b> Die Aktivit?t der GMD zeigt f?r die Cofaktoren NADP und NADPH S?ttigungskinetiken. NADPH aktiviert das Enzym. Ein formalkinetisches Modell der Cofaktor-abh?ngigen Enzymaktivierung wurde aufgestellt. Das Modell ist in der Lage, die Aktivierung der GMD durch die Cofaktoren zu beschreiben. GKDM liegt in w?ssriger L?sung in einer Keto- und einer Ketohydratform vor. Mittels NMR-Analytik konnten diese beiden Formen des Nucleotidzuckers erstmalig identifiziert werden. In Abh?ngigkeit des Cofaktors - NADPH bzw. NADH - besitzt die GFS unterschiedliche Affinit?t zu GKDM. Die Reaktionsgeschwindigkeit der GFS-Reaktion kann durch eine erweiterte <i>Michaelis-Menten</i>-Gleichung mit zwei Substraten und kompetitiver Inhibierung durch beide Produkte beschrieben werden. <br /><b>Syntheseverfahren</b> Im diskontinuierlichen Verfahren wurde GDP-Fuc durch die Kombination eines <i>batch</i>- (GMD) und eines <i>repetitive batch</i>-Verfahrens (GFS) in Ausbeuten von 90-95% f?r die einzelnen Schritte gewonnen. Erstmalig konnte mit einer zweistufigen R?hrkesselkaskade ein kontinuierliches Verfahren zur Synthese von GDP-Fuc etabliert werden. Wie beim diskontinuierlichen Verfahren wurde dabei die r?umliche Trennung von GMD- und GFS-Reaktion genutzt, um eine <i>feedback</i>-Inhibierung der GMD durch GDP-Fuc zu vermeiden. Die Aufreinigung der enzymatisch gewonnenen GDP-Fuc gelang in einem dreistufigen Verfahren bestehend aus Ultrafiltration, Ionenaustausch-Chromatographie und Nanofiltration. Die Gesamtausbeute f?r Synthese und Reinigung der GDP-Fuc betrug 63%. <br /> Durch die Kopplung der GDP-Fuc Synthese mit einer FucT-Reaktion konnte ein weiteres Konzept zur Vermeidung der <i>feedback</i>-Inhibierung der GMD durch GDP-Fuc erfolgreich realisiert werden. Dabei wurde ausgenutzt, dass <i>in situ</i> gebildete GDP-Fuc sehr schnell von der FucT auf einen Akzeptor ?bertragen wurde. Mit diesem Eintopfverfahren konnten verschiedene Akzeptoren mit Ausbeuten zwischen 70 und 99% (bezogen auf GDP-Man) fucosyliert werden. <br /> Die Ergebnisse wurden teilweise in Kooperation mit akademischen und industriellen Partnern erzielt. Einzelheiten finden sich in den jeweiligen Kapiteln der Arbeit.

<strong>Reaction engineering of the enzymatic <i>de novo</i> synthesis of GDP-β-L-fucose and <i>in situ</i> fucosylation of oligosaccharides</strong><br /> Many inter- and intracellular recognition processes base on the interaction of oligosaccharides with other (macro-)molecules. Well-known examples are viral or bacterial infections, inflammation or fertilization. In mammals, the monosaccharide and deoxy sugar L-fucose is crucial for a multitude of biological processes. <i>In vivo</i>, enzymatic synthesis of fucosylated oligosaccharides is catalyzed by the <i>Leloir</i>-fucosyltransferases (FucTs). These enzymes require GDP-β-L-fucose (GDP-Fuc) as the donor. GDP-Fuc is one of the most expensive and unavailable nucleotide sugars. In consequence, large-scale <i>in vitro</i> syntheses of fucosylated compounds still remain difficult due to the low availability of GDP-Fuc. <br /><b>Objective</b> The objective of this work was the development of processes for enzymatic synthesis of GDP-Fuc by using the enzymes of the <i>de novo</i> pathway: GDP-α-D-mannose-4,6-dehydratase (GMD) and GDP-β-L-fucose synthetase (GFS). These enzymes catalyze the synthesis of GDP-Fuc starting from GDP-α-D-mannose (GDP-Man) <i>via</i> the intermediate GDP-4-keto-6-deoxy-α-D-mannose (GKDM). Since GDP-Fuc strongly decreases GMD activity by a feedback inhibition, the design of processes that omit this kinetic drawback is imperative. By coupling the reaction system for GDP-Fuc synthesis with a α1,2-fucosyltransferase (α1,2-FucT) reaction, the concept of a <i>one-pot</i> fucosylation of oligosaccharides was investigated within this framework. <br /><b>Analytical methods & enzyme production</b> Robust means for the quantification of enzyme activities were provided. An enzyme assay based on capillary electrophoresis and suitable for GMD activity measurement was developed by using a genetic algorithm approach. Recombinant GMD and GFS as well as a recombinant α1,2-FucT from <i>Helicobacter pylori</i> were produced by fermentation of the respective rec. <i>E. coli</i> strains. Further downstream processing of GMD was performed by the means of ion exchange chromatography, GFS and the α1,2-FucT were purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). <br /><b>Enzyme kinetics</b> GMD activity revealed saturation kinetics for the cofactors NADP and NADPH, respectively. NADPH activates the dehydratase. A kinetic model for the cofactor-dependent enzyme activation was established. Activation of GMD by the nicotinamide cofactors NADP and/or NADPH is described by this model. GKDM exists in two different forms in aqueous solution, which, for the first time, were identified as the ketone and the respective hydrate form of GKDM. GFS has a different affinity for GKDM depending on the cofactor (NADPH or NADH). The rate of GFS reaction is described by an extended <i>Michaelis-Menten</i> equation with two substrates and competitive inhibition by both products. <br /><b>Process design</b> In a discontinuous process, GDP-Fuc was produced by combining a batch reactor (GMD) with a repetitive batch reactor (GFS). Yields were in the range of 90-95% for each step. For the first time, a continuous process for the production of GDP-Fuc was established with a two-stage CSTR cascade. As in the discontinuous process, the physical separation of GMD and GFS reaction avoids the feedback inhibition of GMD by GDP-Fuc. Purification of produced GDP-Fuc was achieved by a three step procedure consisting of ultrafiltration, ion exchange chromatography and nanofiltration. Overall yield for GDP-Fuc production and purification was 63%. <br /> A different approach to prevent inhibition of GMD by GDP-Fuc could be realized by coupling the reaction system for GDP-Fuc synthesis with a α1,2-FucT reaction. <i>In situ</i> produced GDP-Fuc is immediately transferred on the acceptor by the FucT. Thus, inhibition of GMD can be avoided. Using this <i>one-pot</i> synthesis approach, different oligosaccharides could be fucosylated with yields in the range of 70 to 99%.