Erzeugung und Charakterisierung verschiedener Mauslinien zur zelltypspezifischen Deletion, Expression und Substitution von Connexingenen

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe verschiedener transgener Mausmodelle die Funktion unterschiedlicher Vertreter der Connexin-Genfamilie untersucht.<br /> Durch die Erzeugung von Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäusen zur Tamoxifen-induzierbaren Deletion der Cx43-kodierenden Region in viszeralen glatten Muskelzellen wurde eine nahezu vollständige Ausschaltung im Darm bzw. eine 30- bis 40-prozentige Ausschaltung im Uterus erreicht. Funktionell zeigten diese Tiere Veränderungen in der Kontraktionsfähigkeit der glatten Muskulatur, eine um 29% verringerte gastrointestinale Transitzeit und eine um mehr als das Doppelte erhöhte viszerale Schmerzwahrnehmung. Histologisch wiesen die Tiere Veränderungen der Schrittmacherzellen des gastrointestinalen Traktes (Cajal-Zellen), eine 13-fach erhöhte Infiltration mit neutrophilen Zellen sowie eine hypertrophierte Darmwand auf. Die Gesamtheit dieser Symptome ähnelte stark bekannten gastrointestinalen Krankheitssymptomen des Menschen, wie z.B. dem Reizdarmsyndrom oder der chronischen intestinalen Pseudo-Obstruktion. Daher könnten diese Tiere neue Impulse für das Verständnis der Aetiologie intestinaler Erkrankungen liefern.<br /> In Tamoxifen-behandelten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Weibchen konnte ein Zusammenhang zwischen dem Glattmuskel-spezifischen Verlust der Cx43-vermittelten Kopplung und dem Auftreten von Geburtsproblemen nachgewiesen werden. Mehr als 80% dieser Tiere zeigten eine Verlängerung des Geburtsvorgangs. Molekular wurde dieser Defekt nicht von veränderten endogenen Hormonkonzentrationen oder der Regulation Kontraktions-abhängiger Protein-Gene bestimmt, sondern konnte allein durch die eingeschränkte Gap Junction-vermittelte Kopplung zwischen myometrialen Zellen begründet werden. Klinisch könnten diese Erkenntnisse beispielsweise zur Therapie frühgeburtlicher Kontraktionen des Uterusmuskels beitragen.<br /> Ein Verlust der Cx43-abhängigen koordinierten Kontraktion viszeraler glatter Muskelzellen kann somit in funktionellen physiologischen Konsequenzen sowohl im Darm als auch im Uterus resultieren.<br /> Zur Untersuchung der spezifischen Relevanz der neuronalen Cx43-Regulation während der Gehirnentwicklung wurden durch Vorkerninjektion des Vektorkonstrukts pTetOCMVbi-Cx43-eGFP-Isolator transgene Cx43^TetOeGFP-Tiere hergestellt und charakterisiert. Durch Verpaarung mit CaMKIIα-tTA-Mäusen wurde eine Neuronen-spezifische Expression des Cx43- und des eGFP-Reportergens erreicht. Neben motorischen und Angst-assoziierten Verhaltensänderungen zeigten diese Tiere Unterschiede in cerebralen Neurotransmitterkonzentrationen sowie eine verstärkte Epilepsie-Anfälligkeit. Weiter wurden histologische Veränderungen der Zytostruktur des Hippocampus festgestellt, die möglicherweise durch eine Cx43-abhängige, veränderte neuronalen Migration begründet sind. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die entwicklungsspezifische Regulation der neuronalen Cx43-Expression einen entscheidenden Einfluss auf die Physiologie des Gehirns besitzt und die Entkopplung der Neurone während der Differenzierung ein wichtiges Merkmal der Cortikogenese darstellt.<br /> Zur Überprüfung der funktionellen Ersetzbarkeit von Cx45- durch Cx36-Gap Junction-Kanäle wurde ein Austauschvektor zur homologen Rekombination in embryonalen Maus-Stammzellen kloniert. Nach Transfektion des Vektors und Selektion der ES-Zellen wurden über Blastozysteninjektionen dieser Zellen chimären Mäuse hergestellt. Durch die Verpaarung der Chimären mit C75BL/6-Mäusen wurde die transgene Mauslinie Cx45KI36 etabliert. Tiere, die homozygot für den Austausch der Cx45- gegen die Cx36-kodierende Region im gesamten Körper waren, starben zwischen Tag 10,5 und 11,5 der Embryonalentwicklung und damit einen Tag später als Cx45-defiziente Mäuse. Daher scheint Cx36 zumindest transient die Funktionen von Cx45 in der Entwicklung übernehmen zu können. Erste Untersuchungen zum zelltypspezifischen Ersatz des Cx45- durch das Cx36-Gen in der Retina wiesen ebenfalls auf eine gewisse funktionelle Redundanz der beiden Proteine hin. Somit wurde ein Mausmodell erzeugt, dass zum weiteren funktionalen Verständnis der hohen, in Säugern bestehenden Connexindiversität beitragen kann.