Laccasen und Laccasegene des acidophilen Ascomyceten <i>Hortaea acidophila</i>

Abstract

<em>Hortaea acidophila</em> ist ein acidophiler Ascomycet der Ordnung Dothideales und bildet DHN-Melanin, an dessen Synthese u. a. Laccasen beteiligt sind. Bei diesen Enzymen handelt es sich um Polyphenoloxidasen mit vier Kupferatomen im katalytischen Zentrum. Laccasen werden industriell u. a. zur Papierbleiche, in der Textilindustrie und zur Modifikation von Naturstoffen genutzt. Da <em>H. acidophila</em> bei einem pH-Wert von 0,6 wachsen kann, ist davon auszugehen, dass die gebildeten Laccasen an saure Umweltbedingungen angepasst sind und somit interessante Eigenschaften für eine biotechnologische Nutzung besitzen. Um eine heterologe Expression der Laccasen zu ermöglichen, war es Aufgabe der vorliegenden Arbeit, <em>H. acidophila</em> für genetische Arbeiten zu erschließen und die Laccasegene zu isolieren.<br /> Nach dem Nachweis extrazellulärer und zellassoziierter oxidativer Enzyme von <em>H. acidophila</em>, von denen zumindest die sezernierte Oxidase mit ihrer Kupferabhängigkeit und der Unfähigkeit Tyrosin zu oxidieren Eigenschaften einer Laccase besitzt, erfolgte ein Nachweis der Enzyme über laccasespezifische Antikörper. Die kompetitive Hemmung der Oxidasen durch Ascorbinsäure wies auf eine Beteiligung der Enzyme an der Melaninsynthese hin. Die Laccasegene wurden über Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Primern nachgewiesen, die von den konservierten Kupferbinderegionen abgeleitet worden waren. Es wurden vier Fragmente amplifiziert, die als Grundlage für eine inverse PCR dienten. Die Laccasegene <em>lacc1</em> und <em>lacc2</em> konnten so vollständig, <em>lacc3</em> und <em>lacc4</em> teilweise sequenziert werden.<br /> Während das hypothetische Protein <em>Lacc1</em> eine N-terminale Signalsequenz für den Proteinexport und 9 potenzielle N-Glykosylierungsstellen aufweist, besitzt <em>Lacc2</em> keine Signalsequenz und nur 2 potenzielle N-Glykosylierungsstellen und ist deshalb mit großer Wahrscheinlichkeit in cytoplasmatischen, melanosomenartigen Organellen lokalisiert. Alle vier hypothetischen Proteine weisen sehr geringe Sequenzähnlichkeiten zu anderen Laccasen auf, und auch untereinander unterscheiden sich die Laccasen aus <em>H. acidophila</em> ungewöhnlich stark. <em>Lacc1</em> und <em>Lacc2</em> weisen einige Merkmale von Proteinen auf, die an ein saures Milieu angepasst sind, darunter vor allem eine deutliche Herabsetzung der Anzahl geladener Aminosäuren.<br /> Mit diesen Ergebnissen sind die Grundlagen geschaffen, um die Laccasegene heterolog zu exprimieren. In Zukunft muss die Laccase mit den interessantesten Eigenschaften für den Einsatz in der Industrie bestimmt und das dazugehörige Gen für die Expression in einem geeigneten Expressionssystem vorbereitet werden.

<strong>Laccases and laccase genes of the acidophilic ascomycete <i>Hortaea acidophila</i></strong><br /><em>Hortaea acidophila</em> is an acidophilic ascomycete of the order Dothideales that produces DHN-melanin via the polyketid synthesis pathway which involves laccases. These enzymes are polyphenol oxidases with four copper atoms in the catalytic centre. Laccases are widely used in industrial processes especially in the paper and textile industry and in the field of natural compound modification. Its laccases are probably adapted to acidic conditions and thus exhibit interesting features for biotechnological use. In order to enable a heterologous expression of the laccases it was the aim of this work to establish molecular biological methods for <em>H. acidophila </em>and to isolate its laccase genes. <br /> After the detection of extracellular and cell associated oxidative enzymes in <em>H. acidophila</em> of which at least one was proven to be a laccase due to its dependence on copper and its unability to oxidize tyrosine, the existence of laccases was also shown by using specific antibodies. Competitive inhibition of the enzymes showed their involvement in melanin synthesis. The laccase genes were detected by polymerase chain reaction (PCR) using primers designed from the conserved copper binding sequences. Four fragments were amplified that were used for the sequencing of the complete genes <em>lacc1</em> and <em>lacc2</em> and of parts of the genes <em>lacc3</em> and <em>lacc4</em> by inverse PCR.<br /> Whereas the hypothetical protein <em>Lacc1</em> exhibits an N-terminal signal sequence for protein export and 9 potential N-glycosylation sites, <em>Lacc2</em> does not contain a signal sequence and exhibits only 2 potential N-glycosylation sites which makes a localisation of Lacc2 in cytoplasmic melanosome-like organelles probable. All four hypothetical proteins have low sequence similarity to other laccases und even among the laccases of <em>H. acidophila</em> the conservation is quite low. <em>Lacc1</em> and <em>Lacc2</em> exhibit some features of proteins adapted to low pH values especially a significant decrease in the amount of charged amino acids. <br /> These results have paved the way for heterologous expression of the laccase genes of <em>H. acidophila</em>. In future experiments the laccase with the most interesting features for industrial use has to be determined in order to prepare the corresponding gene for its expression in a suitable expression system.