Die Protein–Lipid–Bindung in der epidermalen Permeabilitätsbarriere

Abstract

Die transepidermale Permeabilitätsbarriere ist in der äußersten Schicht der Epidermis, dem Stratum corneum (SC), lokalisiert. Dort sind terminal differenzierte Keratinozyten (Korneozyten) in eine multilamellare Matrix aus Fettsäuren, Cholesterol und einer Familie von hautspezifischen Ceramiden eingebettet. Die Korneozyten besitzen anstelle einer Plasmamembran ein hochgradig quervernetztes Proteingerüst, den Cornified envelope (CE). An die Proteine des CE sind omega-OH-Ceramide gebunden. Sie bilden mit ihrer omega-OH-Gruppe Esterbindungen zu sauren Aminosäureseitenketten des CE aus.<br /> Die Existenz der omega-OH-Ceramide in der Epidermis ist einzigartig und fordert die Funktion einer omega-Hydroxylase. Die Identität dieses Enzyms ist bis heute nicht geklärt. Aufgrund einiger bekannter Eigenschaften des Enzyms wurde im Rahmen dieser Arbeit die Zielstruktur eines potentiellen Suizidinhibitors entwickelt. Anhand dieser Zielstruktur wurden zwei potentielle Suizidinhibitoren der epidermalen omega-Hydroxylase synthetisiert und ihre Wirkung in humanen kultivierten Keratinozyten untersucht. Beide Substanzen inhibieren das Enzym in mikromolaren Konzentrationen um bis zu 80%. <br /> Im zweiten Teil der Arbeit sollten mit massenspektrometrischen Methoden diejenigen Aminosäuren in den Proteinen des CE identifiziert werden, die mit omega-OH-Lipiden verknüpft sind und somit die Protein-Lipid-Bindungsstellen darstellen. Um die Heterogenität der proteingebundenen Lipide und die damit verbundenen Komplexität entsprechender Massenspektren zu umgehen, wurde eine Methode entwickelt, bei der die Lipidester durch Behandlung mit Natriummethanolat in Methylester überführt werden. Es konnte gezeigt werden, dass dabei nur veresterte Glutamate reagieren. Glutamine und freie Glutamate bleiben unverändert. Ferner konnten die entstandenen Glutaminsäuremethylester massenspektrometrisch eindeutig identifiziert werden. In weiteren Untersuchungen in humanem SC konnten nach Umesterung Peptide mit Glutaminsäuremethylestern anstelle von Glutamin oder Glutamat identifiziert werden und den Proteinen Keratin 1 und Keratin 10 zugeordnet werden. Leider zeigte sich in späteren Kontrollexperimenten, dass diese Methylester während einer lang andauernden Extraktion mit Chloroform und Methanol artifiziell entstanden waren. <br /> Um die in großen Mengen vorhandenen und störenden Keratine anzutrennen, wurde CE nach einer beschriebenen Methode isoliert. Für diese Präparation wurde eine Bilanz erstellt, die bezogen auf das Trockengewicht eine Materialausbeute von 1,5 % ergab. Die Menge an proteingebundenen Lipiden konnte dagegen nur um den Faktor 2,5 angereichert werden. Es gelang jedoch bei dieser Präparation, reines CE zu gewinnen und die Keratine vollständig zu entfernen. <br /> Die nun folgende proteolytische Spaltung des CE stellte sich als sehr problematisch heraus. Selbst eine beschriebene Methode zur Spaltung konnte nicht reproduziert werden. Darüber hinaus wurde durch vielfältige Variationen der Proteolyse-Bedingungen wie z.B. der Vorbehandlung der CE-Proben, der verwendeten Protease, der Dauer des Verdaus oder der Konzentrationen von CE bzw. Protease versucht, aus CE Peptide freizusetzen. Trotz dieser zahlreichen Abwandlungen gelang es nicht, Bedingungen zu finden, unter denen reproduzierbar Peptide generiert werden konnten. In einzelnen Experimenten konnten Peptide anhand von ESI-MS/MS-Spektren sequenziert und als Peptide aus Loricrin identifiziert werden. Teilweise waren die identifizierten Peptide über Isodipeptidbindungen an andere Peptide gebunden. <br /> Da die oben beschriebene Proteolyse von Peptiden nicht zuverlässig reproduzierbar war, wurde eine Methode entwickelt, bei der Peptidketten durch Behandlung mit Natriummethanolat selektiv N-terminal von Glutaminsäureestern gespalten werden. Dabei entsteht aus dem veresterten Glutamat ein Pyroglutamat, das im MS/MS-Spektrum als b1-Ion der Masse 112,04 amu detektiert wird. Diese Affinitätsspaltung wurde an einem Modellpeptid bewiesen. Durch die Affinitätsspaltung sollten aus CE nur Peptide freigesetzt werden, die sich zwischen zwei Glutaminsäureestern, also zwischen zwei Protein-Lipid-Bindungsstellen, befinden. Nach Optimierung der Bedingungen konnten mit Hilfe der Affinitätsspaltung Peptide erhalten werden, deren ESI-QToF-MS/MS-Spektren einen Peak bei 112 amu zeigten. Diese Spektren waren jedoch nicht interpretierbar, da offensichtlich weitere, bis jetzt nicht bekannte, Modifizierungen stattgefunden haben. Weitergehende Messungen am ESI-FT-ICR-Massenspektrometer, dessen Massengenauigkeit sehr viel höher ist, ergaben außerdem, dass es sich bei dem Fragment mit der Masse 112 amu aus den aus CE freigesetzten Peptiden nicht um das b1-Ion eines Pyroglutamats handelt. Die Bedingungen der Affinitätsspaltung müssen also noch optimiert werden. Zum anderen müssen die Modifizierungen, die vermutlich an den Isodipeptidbindungen stattfinden, aufgeklärt werden.