Proanthocyanidins in barley and malt analyzed by pressurized liquid extraction, solid-phase extraction and HPLC

Abstract

Aim of this work is to develop a convenient method for the determination of proanthocyanidins in barley and malt. In a second step this method is applied to 61 barley and malt samples of different varieties, proveniences and growing years. In the brewing industry proanthocyanidins are of special interest. Main activities of the proanthocyanidins are related to undesired formation of chill haze and to the positively valued augmentation of the antioxidative capacity of beer. The detailed mechanisms are still under discussion. It is clear, that the positive and negative effects of proanthocyanidins depend on their quantity and quality. So determination of the sum of proanthocyanidins does not give sufficient information to discuss their action.<br /> Selective analysis of proanthocyanidins is time and labor consuming. Especially sample preparation requires a lot of manual work. Thus, this work presents a fully automated and therefore fast and reliable method for sample preparation of barley and malt followed by HPLC-UV. <br /> The here described method bases on extraction using pressurized liquid extraction (PLE). Essentially it is a static solid/liquid extraction with high pressure and eventually high temperature in stainless steel extraction cells. Using the Accelerated Solvent Extractor (ASE) by Dionex, up to 24 samples in a series can be extracted automatically. <br /> For the first time, commercially available polyamide cartridges are used for proanthocyanidins. SPE is accomplished automatically by a liquid handling robot, the Automated Sample Preparation with Extraction Cartridges-device (ASPEC) by ABIMED and Gilson. The aspec takes the extracts from the ase and carries out the complete spe procedure. The resulting solution is ready to inject into the HPLC, that separates and quantifies six proanthocyanidins and catechin in one run of 90 min. Sample extraction and extract clean-up are coupled online. This coupling was developed by abimed and Dionex and is tested and established under real laboratory conditions for the first time. Within 24 hours 16 samples can be analyzed, about 6 hours of manual work is needed. Recovery of the overall method is 70–91%, reproducibility is 2.3–6.4%. <br /> With this method 61 barley and malt samples of the growing years 1998– 2001 from four locations including summer and winter barley varieties are analyzed. The annual and local variation of absolute contents of proanthocyanidins appears to interfere varietal differences, so differentiation between the samples is not possible. The ratio of several pairs of proanthocyanidins (the relative quantitative polyphenolic fingerprint) is characteristic for the variety and can be used to control authenticity. <br /> In addition, the here presented method is supposed to be applicable to samples taken during the brewing process and to other food samples. Two examples are given: monitoring beer filtration and analyzing proanthocyanidins in the seeds of the açaí fruit from northern Brazil. Since proanthocyanidins are discussed to have positive effects on health, there is a market for functional food with naturally high or enriched content of proanthocyanidins. Hence it is necessary to control such products.

<strong>Proanthocyanidine in Gerste und Malz analysiert mit Hochdruck-Flüssig-Extraktion, Festphasenaufreinigung und HPLC</strong><br /> Ziel dieser Arbeit ist, eine leicht durchf ührbare Methode zur selektiven Bestimmung von Proanthocyanidinen in Gerste und Malz zu entwickeln. Als zweiter Schritt wird diese Methode auf 61 Gersten- und Malzproben verschiedener Sorten, Anbauorte und Jahrgänge angewandt.<br /> Im Brauereiwesen spielen die Proanthocyanidine eine wichtige Rolle. Die wichtigsten Eigenschaften der Proanthocyanidine sind die Bildung von unerwünschten Kältetrübungen und die positiv bewertete Erhöhung der antioxidativen Kapazität des Bieres. Die einzelnen Reaktionen und genauen Mechanismen sind noch Gegenstand wissenschaftlicher Diskussion. Fest steht, dass die positiven und negativen Effekte der Proanthocyanidine von ihrer Art und Menge abhängen. Daher bringt die Bestimmung von Summenparametern keine ausreichende Information, um die Wirkungen zu diskutieren. <br /> Die selektive Analyse von Proanthocyanidinen ist sowohl zeit- als auch arbeitsaufwendig – vor allem die Probenvorbereitung erfordert viel Handarbeit. Hier wird eine vollautomatische und daher schnelle und zuverlässige Methode für die Probenvorbereitung von Gerste und Malz zur anschließenden HPLC-UV-Analyse vorgestellt.<br /> Die hier beschriebene Methode basiert auf der Extraktion mittels beschleunigter Lösemittelextraktion (pressurized liquid extraction (PLE)). Im wesentlichen ist dies eine statische fest/flüssig- Extraktion unter hohem Druck und ggf. hoher Temperatur in Edelstahlzellen. Mit dem Accelerated Solvent Extractor (ASE) von Dionex können bis zu 24 Proben in Serie automatisch extrahiert werden. <br /> Der zweite Schritt der Probenvorbereitung ist die Aufreinigung mit Festphasenextraktion (solid-phase extraction (SPE)). Zum ersten Mal werden kommerziell erhältliche Polyamid-Kartuschen zur Aufreinigung von Proanthocyanidinen eingesetzt. Die SPE wird vollautomatisch von einem Pipettierrobotor, dem Automated Sample Preparation with Extraction Cartridges-Gerät (ASPEC) von ABIMED und Gilson, durchgeführt. Der ASPEC übernimmt die Extrakte von der ASE und führt die komplette SPE durch. Die resultierende Lösung kann direkt in die HPLC injiziert werden, die sechs Proanthocyanidine und Catechin innerhalb eines Laufes von 90 min trennt. Die Probenextraktion und -aufreinigung sind online gekoppelt. Diese Kopplung wurde von ABIMED und Dionex entwickelt und wird zum ersten Mal unter realen Labor-Bedingungen getestet und eingesetzt. Innerhalb von 24 Stunden können 16 Proben analysiert werden, dabei sind etwa 6 Stunden Personaleinsatz erforderlich. Die Wiederfindung der gesamten Methode beträgt 70–91%, die Reproduzierbarkeit 2.3–6.4%. Mit dieser Methode wurden 61 Gersten- und Malzsorten, darunter Sommer- und Wintergersten der Jahrgänge 1998–2001 von vier Anbauorten analysiert. Die jährlichen und lokalen Unterschiede überlagern die Sortenunterschiede, so dass keine Differenzierung zwischen den Proben möglich ist. Das Verhältnis bestimmter Paare von Proanthocyanidinen (der relative quantitative polyphenolische Fingerabdruck) ist jedoch charakteristisch für die Gerstensorte und kann zur Authentizitätskontrolle genutzt werden. <br /> Außerdem kann die hier vorgestellte Methode auch eingesetzt werden, um Proben aus dem Brauprozess oder andere Lebensmittel zu untersuchen. Zwei Beispiele sind angeführt: die Überwachung der Bierfiltration und die Analyse von Samen der nordbrasilianischen Açaí- Frucht. Da Proanthocyanidine als gesundheitsförderlich diskutiert werden, gibt es einen Markt für Lebensmittel, die natürlicherweise viele Proanthocyanidine enthalten oder damit angereichert sind. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, solche Produkte zu überprüfen.