Biochemische und strukturelle Untersuchungen der Proteine DsrE, DsrF, DsrH und DsrC aus <i>Allochromatium vinosum</i>

Abstract

1) Die Entwicklung einer geeigneten chromatographischen Methode ermöglichte, dass die löslichen Dsr-Proteine, DsrE, DsrF und DsrH zum ersten Mal aus dem Cytoplasma des Schwefelpurpurbakteriums <i>A. vinosum</i> isoliert und homogen aufgereinigt werden konnten. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine nicht einzeln sondern zusammen gehören und ein Proteinheterohexamer darstellen, mit einer Struktur von alpha2beta2gamma2. <br /> 2) Die Elektronen-Spray-Ionisations-Massenspektroskopie bestätigte die Peptidsequenzen und die bislang postulierten molekularen Massen für die Proteine DsrE, DsrF und DsrH aus <i>A. vinosum</i>, sowie auch die Massen der rekombinanten DsrEFH Proteine. Keine der drei Untereinheiten bildete Addukte mit Schwefelverbindungen.<br /> 3) Inkubationsuntersuchungen des rekombinanten DsrEFH-Proteins mit reduzierenden und alkylierenden Agenzien zeigten, dass die Proteine DsrE, DsrF und DsrH nicht über eine kovalente Disulfidbrücke verbunden sind. <br /> 4) Datenbankuntersuchungen zeigten, dass es DsrE-, DsrF- und DsrH-homologe Proteine in schwefeloxidierenden Bakterien gibt. Homologe DsrEFH-Proteine gibt es in sulfatreduzierenden Organismen nicht. DsrEFH-homologe Proteine aus <i>C. tepidum, T .denitrificans, M. magnetotacticum</i>, und <i>Magnetococcus sp.</i> fallen mit dem DsrEFH aus <i>A. vinosum </i> in einer Gruppe zusammen (Sander, 2005) und weisen einen hohen Verwandtschaftsgrad auf, der darauf hindeutet, dass diese aus einem gemeinsamen Vorfahren hervorgegangen sind. <br /> 5) Die Röntgenkristallisationsmethode bestätigte dass DsrEFH ein Proteinheterohexamer ist. DsrE aus <i>A. vinosum </i> und das homologe YchN-Protein aus <i>E. coli </i> K12 besitzen einen hoch konservierten Cysteinrest (Cys78), der von vielen hydrophoben, Aminosäureresten in einer ähnlichen Anordnung umgeben wird. Eine hydrophobe Umgebung um hoch konservierte Cysteinreste könnte für die Funktionalität des Proteins essentiell sein. Möglicherweise handelt es sich um das aktive Zentrum der Proteine. <br /> 6) DsrEFH hat keine Rhodaneseaktivität. <br /> 7) Der Umsatz reduzierter Schwefelverbindungen durch die <i>Mutante deltadsrEFH </i> wurde im Vergleich zum Wildtyp analysiert. <i>A. vinosum deltadsrEFH</i> zeigte eine um 92 % erniedrigte Schwefeloxidationsrate. Das lässt den Schluss zu, dass DsrEFH eine bedeutende Rolle in der Oxidation gespeicherten Schwefels spielt. <br /> 8) Ein unter nicht reduzierenden Bedingungen aufgereinigtes rekombinantes DsrC-Protein kann zwei Konformationszustände annehmen. Das Monomer (13,6 kDa) und das Dimer (28,2 kDa) wurden mit Hilfe der ESI-MS-Analyse bestätigt. Die Disulfidbrücke im DsrC-Dimer konnte mit reduzierenden und alkylierenden Reagenzien gespalten werden. <br /> 9) Eine Strukturanalyse mittels der NMR-Spektroskopie zeigte, dass DsrC aus <i>A. vinosum</i> dem DsrC-Proteins aus <i>P. aerophilum </i> sehr ähnlich ist. DsrC besteht aus einem orthogonal helical angeordnetem Bündel von alpha-Helices mit einer C-terminal liegenden unstrukturierten beta-Haarnadel. Der unstrukturierte Arm, der aus der Mitte des Proteins herausragt, ist relativ flexibel und besteht aus sieben Aminosäureresten, die in allen bislang verglichenen DsrC-Proteinen aus Schwefeloxidierern und Sulfatreduzierern hoch konserviert sind. Die hoch konservierten Cysteinreste (Cys111 und Cys100) könnten einerseits essentiell sein für die Katalyse von Redoxreaktionen, andererseits aber auch stabilisierende Funktion für das DsrC-Protein haben. <br /> 10) Eine Inkubation des aufgereinigten rekombinanten DsrEFH mit DsrC ruft eine Veränderung in DsrEFH hervor, möglicherweise eine Änderung in seiner Konformation, die auf eine Multimerisierung des Proteins hindeuten könnte.