Transcriptional analysis of biopsies derived from in vitro produced bovine blastocysts in relation to pregnancy success after transfer to recipients

Abstract

This study was carried out to address the relationship between the transcriptional profile of embryos and the pregnancy success based on gene expression analysis of blastocyst biopsies taken prior to transfer to recipients. For this, biopsies (30-40% of the intact embryo) were taken from day 7. Blastocysts (n=118) and 60-70% part were transferred to recipients after re-expansion. Based on the success of pregnancy, biopsies were pooled in three groups (each 10 biopsies) namely: those resulting in no pregnancy (G1), resorption (G2) and those resulting in delivery of calf (G3). Gene expression analysis of these groups was performed using a home made bovine preimplantation specific cDNA array (with 219 clones) and BlueChip (with ~2000 clones). Data analysis using Significant Analysis for Microarray (SAM) software revealed that a total of 52 and 58 genes were differentially regulated during comparison between G1 versus G3 and G2 versus G3 respectively. Quantitative real-time PCR was used to validate the results of the microarray experiments. G3-Biopsies are enriched with genes necessary for implantation (COX-2 and CDX2), carbohydrate metabolism (ALOX15), growth factor (BMP15), response to oxidative stress (TXN), signal transduction (PLAU) and placenta-specific 8 (PLAC8). G2-Biopsies are enriched with transcripts involved protein phosphorylation (KRT8), plasma membrane (OCLN) and glucose metabolism (PGK, AKR1B1). G1-Biopsies are enriched with transcripts involved inflammatory cytokines (TNF), and factors relevant for protein amino acid binding (EEF1A1), transcription factors (MSX1, PTTG1), glucose metabolism (PGK1, AKR1B1) and CD9 which is an inhibitor of implantation. The bovine MSX1 protein detected by immunohistochemistry was localized in the cytoplasm of immature oocytes and distributed at periphery of the cytoplasm of matured oocytes. Throughout the preimplantation period the staining was apparently more concentrated around the nuclei, whereas the ICM in blastocyst showed weaker labelling for MSX1 than the trophectoderm. In conclusion, we generated direct candidates of genes which may play an important role in determining the fate of the embryo after transfer.

<strong> Genexpressionsprofile von in vitro produzierten Rinderembryobiopsien in Relation zur in vivo Entwicklung nach Transfer </strong> <br /> In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen Genexpression in Embryonen und Trächtigkeitserfolg, basierend auf der Expressionsanalyse von vor dem Transfer an den Rezipienten gewonnenen Blastozystenbiopsien, untersucht. Hierzu wurden Biopsien (30- 40% des intakten Embryos) von Tag 7 Blastozysten genommen (n=118) und der 60-70% Restteil den Rezipienten nach Re-expansion transferiert. Basierend auf dem Erfolg der Trächtigkeit wurden die Biopsien in 3 Gruppen (je 10 Biopsien) gepoolt, nämlich: jene, die in keiner Trächtigkeit resultierten (G1), resorbierte Embryonen (G2) und jene, die in Geburt eines Kalbes resultierten (G3). Die Genexpressionsanalyse dieser Gruppen wurde mit einem selbsthergestellten bovinen präimplantationsspezifischen cDNA Array (mit 219 Clonen) und mit BlueChip (mit ~2000 Clonen) durchgeführt. Die Datenanalyse mittels Significant Analysis for Microarray (SAM) Software zeigte insgesamt 52 bzw. 58 unterschiedlich regulierte Gene im Vergleich zwischen G1 versus G3 und G2 versus G3. Quantitative real-time PCR wurde zur Bestätigung der durch das Microarray-Experiment entdeckten unterschiedlich exprimierten Gene eingesetzt. G3-Biopsien exprimierten herstäarkt solche Gene, die notwendig für Implantation (COX-2 und CDX2), Kohlenhydratmetabolismus (ALOX15), Wachstum (BMP15), oxidative Stressantwort (TXN), Signalübermittlung (PLAU) und Plazentafunktion-8 (PLAC8), sind die Biopsien der resorbierten Embryonen zeigten vermehrt Transkripte, die in Protein-phosphorylation (KRT8), Plasmamembranaufbau (OCLN) und Glucosemetabolismus (PGK1, AKR1B1). Involvirt sind die Biopsien von G1-Embryonen, exprimierten vermehrt Transkripte von Zytokinen (TNF), Proteinaminoacidbindung (EEF1A1), Transkriptionfaktoren (MSX1, PTTG1), Enzymen des Glucosemetabolismus (PGK1, AKR1B1) und CD9, einem Inhibitor der Implantation. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass wir direkte Kandidatengene identifiziert haben, die eine wichtige Rolle in der Bestimmung der Enwicklungsfähigheit des Embryos nach dem Transfer spielen könnten.