Glucuronidierung von Paracetamol durch menschliche Lebermikrosomen in vitro

Abstract

Die Glucuronidierung ist ein wichtiger Metabolisierungsschritt im menschlichen Organismus für viele Arzneistoffe, Drogen und körpereigene Stoffwechselprodukte. Durch verschiedene Glucuronyltransferasen in den Lebermikrosomen wird Glucuronsäure an die jeweilige Substanz gebunden, wodurch diese wasserlöslicher wird und besser ausgeschieden werden kann. Da sehr viele Stoffe glucuronidiert werden, kann es dabei zu verschiedenartigen Wechselwirkungen und Konkurrenzen um die Enzyme kommen. Interessant für nähere Untersuchungen dieser Interaktionen sind Substanzen, die auch in vivo häufig gleichzeitig zugeführt und glucuronidiert werden. <br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Glucuronidierung von Paracetamol mithilfe menschlicher Lebermikrosomen untersucht und die Einflüsse von aliphatischen Alkoholen und Opiaten ermittelt. Von besonderem Interesse waren dabei die so genannten Begleitalkohole alkoholischer Getränke, da sie wie Paracetamol in der Leber intensiv metabolisiert und glucuronidiert werden.<br /> Zunächst wurde die Glucuronidierung von Paracetamol untersucht und in Bezug auf Inkubationszeit, Inkubationstemperatur, pH-Wert der Inkubation und Konzentrationen an Substrat und Cosubstrat optimiert. Anschließend wurden zehn verschiedene aliphatische Alkohole, - Methanol, Ethanol, 2-Propanol, n-Propanol, R-2-Butanol, S-2-Butanol, n-Butanol, Isobutanol, n-Pentanol und Isopentanol - als Hemmstoffe der Paracetamol-Glucuronidierung analysiert. Ebenso wurden die Eigenschaften der Opiate Morphin, Codein und Dihydrocodein als Inhibitoren der Paracetamol-Glucuronidierung ermittelt. Weiterhin konnten auch die Einflüsse von Paracetamol auf die Morphin-3-Glucuronidierung und die Codein-Glucuronidierung untersucht werden. Die enzymkinetische Auswertung erfolgte durch die Bestimmung der Parameter K_m, V_max, K_i und der Ermittlung des Hemmtyps. <br /> Alle Alkohole außer Methanol und Ethanol hemmten die Glucuronidierung von Paracetamol. Das Ausmaß der Hemmung war deutlich von der Struktur abhängig. Am stärksten hemmte ein Alkohol, wenn er langkettig, primär und unverzweigt war. Daher hatte n-Pentanol von allen untersuchten Alkoholen das größte Inhibitionspotenzial. Eine Verzweigung in der Alkylkette hatte einen wesentlich geringeren Einfluss auf die Hemmfähigkeit als die Stellung der Hydroxylgruppe (primärer/sekundärer Alkohol), was an den Butanolen zu erkennen war. Die untersuchten Opiate hemmten die Glucuronidierung von Paracetamol stärker als die meisten der getesteten Alkohole. Paracetamol erwies sich ebenfalls als Inhibitor der Opiat-Glucuronidierung, war jedoch ein etwas schwächerer Hemmstoff als umgekehrt. <br /> Die Festlegung des Hemmtyps erwies sich als schwierig. Sowohl bei den hemmenden Alkoholen als auch bei den Opiaten ist am ehesten von einem gemischten Hemmtyp auszugehen, auch wenn hinsichtlich der Opiate die Daten fast die Annahme einer kompetitiven Hemmung nahe legen. <br /> Die durchgeführten In-vitro-Versuche belegen das große Interaktionspotenzial der untersuchten Substanzen. Überträgt man die Ergebnisse auf die Verhältnisse in vivo, so ist eine verstärkte Lebertoxizität durch Paracetamol möglich, sowohl wenn gleichzeitig begleitstoffhaltige alkoholische Getränke - z.B. Obstschnäpse oder Whiskey - in größerer Menge getrunken als auch wenn Opiate - als Schmerz- oder Rauschmittel - in höheren Dosen eingenommen werden.

<strong>Glucuronodation of paracetamol by human liver microsomes in vitro ; enzyme kinetic parameters and effects of short-chain aliphatic alcohols and opiates</strong><br /> Glucuronidation is an important pathway for the elimination of many drugs, narcotics and endogenous metabolic products in the human body. By glucuronosyltransferases in the liver microsomes glucuronic acid is bound to the substrate, which gets more water soluble and can be excreated to a higher extent. As many substances undergo glucuronidation a lot of interactions and competition for the enzymes can occur. To determine these interactions those substances are matter of particular interest, which are often applied together in vivo and are glucuronidated. <br /> In this thesis glucuronidation of paracetamol by human liver microsomes and the effects of aliphatic alcohols and opiates were investigated. The so called congener alcohols in alcoholic beverages were of special interest as they are intensively metabolised in the liver and glucuronidated like paracetamol.<br /> At first glucuronidation of paracetamol was determined and optimised for incubation time, incubation temperature, pH-value of incubation and concentrations of substrate and co-substrate. Afterwards ten different aliphatic alcohols - methanol, ethanol, 2-propanol, n-propanol, R-2-butanol, S-2-butanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol and isopentanol - were analysed as inhibitors of paracetamol glucuronidation. Also qualities of the opiates morphine, codeine and dihydrocodeine as inhibitors of paracetamol glucuronidation were determined. Furthermore the effects of paracetamol on morphine-3-glucuronidation and codein glucuronidation were investigated. Enzyme kinetic analysis was carried out via determination of the parameters K_m, V_max, K_i and the type of inhibition. <br /> Except for methanol and ethanol all alcohols inhibited glucuronidation of paracetamol. The extent of inhibition was clearly dependent on the structure. Inhibition was strongest if the alcohol was long-chained, primary and not branched. Therefore of all tested alcohols n-pentanol had the largest inhibition potential. Branching of the alkyl chain had a lesser effect on the inhibition potential as position of the hydroxyl group (primary/secondary alcohol), which was shown with the butanols. The tested opiates inhibited paracetamol glucuronidation stronger then most of the investigated alcohols. Paracetamol itself turned out to be an inhibitor of opiate glucuronidation but was a weaker inhibitor then the opiates. <br /> Determination of inhibition type was difficult. For the inhibitory alcohols and the opiates a mixed type inhibition seems most obvious, but for the opiates data nearly suggest a competitive type inhibition. <br /> The in vitro studies show a great inhibition potential for the analysed substances. Transferring the results to the in vivo situation a higher liver toxicity of paracetamol can be assumed, if concomitantly a lot of alcoholic beverages with congener alcohols - e.g. fruit schnapps or whisky - are drunk and if opiates - as analgesics or narcotics - are taken in higher doses.