Untersuchungen zur antiangiogenen Wirkung internerKringleregionen des Vorläuferproteins Plasminogen i<i>n vitro</i> und <i>in vivo</i>

Abstract

Das Hepatozelluläre Karzinom ist für betroffene Patienten mit einer seit Jahrzehnten fast unverändert schlechten Prognose verbunden. Insbesondere für fortgeschrittene Tumorstadien stehen überwiegend palliative Behandlungen zur Verfügung. In den letzten Jahren wurden verschiedene Therapieansätze zur Maglinombehandlung experimentell untersucht und teils in die klinische Anwendung transferiert, die auf eine Beeinflussung der Tumorbiologie abzielen. Die Hemmung der für ein fortschreitendes Tumorwachstum wichtigen Tumorgefäß-versorgung stellt prinzipiell einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung des HCC dar. Allgemein hängt ein Tumorprogress von einer ausreichenden Versorgung durch Blutgefäße ab. Die Bildung neuer Blutgefäße kann durch die Gabe angiostatischer Faktoren, wie z.B. Angiostatin, inhibiert und der Tumor dadurch in seinem Wachstum gehemmt werden. Der adenovirale Gentransfer für angiostatisch wirksame Proteine vereint verschiedene Vorteile. Als effiziente Möglickeit des Gentransfers haben sich rekombinante Adenoviren erwiesen. Ziel dieser Arbeit war es, angiostatisch wirksame adenovirale Vektoren herzustellen und zur Behandlung des experimentellen HCC zu nutzen. Dafür wurden aus humanem Gesamt-plasminogen (wthPlg) die Kringle-Regionen K1-4 und K1-5, gewonnen, sowie strangabwärts von K4 und K5 in Wildtyp Plasminogen eine spezifische Restriktionserkennungsstelle für die Endoprotease Furin eingeführt, um eine enzymatische Abspaltung der Kringle-Regionen auf Proteinebene zu ermöglichen. Die entsprechenden Plasminogenderivate sowie wthPlg wurden zur Synthese replikationsdefizienter Adenoviren eingesetzt. Die Vektorfunktion wurde in vitro und in vivo nachgewiesen. Die biologische Aktivität von AdrhPlgK1-4, AdrhPlgK1-5, AdmuthPlgK4, AdmuthPlgK5 und AdwthPlg wurde in vitro anhand des Tube Formation Assays, Proliferationsassays sowie durch Untersuchung der Apoptoserate und in vivo im Matrigel-Assay charakterisiert. Die antitumorale Wirkung der verschiedenen Plasminogen-derivate wurde in einem Lungen- und Leberzellkarzinom Modell untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Plasminogen-derivate im Gegensatz zur Wildtypform die Bildung endothelähnlicher Strukturen in vitro im Vergleich zur Kontrolle deutlich verringerten. Auch die Proliferationsrate von Endothelzellen wurde für AdrhPlgK1-4, AdrhPlgK1-5, AdmuthPlgK4 und AdmuthPlgK5 reduziert. Die Proliferationsrate in Tumorzellen selbst wurde nicht beeinflußt. Deutliche Pro-apoptotische Effekte fanden sich in dieser Arbeit nicht. Auch in vivo konnten für die adenoviralen Vektoren kodierend für die Plasminogenderivate angiostatische Effekte mit einer deutlichen Reduktion der Gefäßinfiltration in sc. Matrigel-Kissen nachgewiesen werden. Insgesamt war die antitumorale Wirksamkeit von AdrhPlgK1-4, AdrhPlgK1-5, AdmuthPlgK4 und AdmuthPlgK5 im HCC-Modell ausgeprägter als im LLC-Modell. Acht Tage nach Behandlungsbeginn war das Tumorwachstum im LLC-Modell um 54% für AdrhPlgK1-4, um 31% für AdrhPlgK1-5, um 40 % für AdmuthPlgK4 und um 32% für AdmuthPlgK5 reduziert. Im HCC-Modell war das Tumorvolumen 12 Tage nach Behandlungsbeginn um 38% für AdrhPlgK1-4, um 67% für AdrhPlgK1-5, um 52% für AdmuthPlgK4 und um 48% für AdmuthPlgK5 reduziert. Die Überlebensrate war bei den mit AdrhPlgK1-4, -K1-5, AdmuthPlgK4 und -K5 behandelten HCC tragenden Mäusen verlängert. 50% der mit AdrhPlgK1-5 behandelten Mäuse waren auch mehr als 3 Monate nach Behandlungsbeginn noch tumorfrei. Die antitumorale Wirksamkeit kann wenigstens teilweise durch die verminderte intratumorale Gefäßdichte erklärt werden. In der Histologie konnte gezeigt werden, daß bei Tieren, die mit den Plasminogenderivaten behandelt wurden, die intratumorale Gefäßdichte im in beiden Tumormodellen signifikant reduziert war. Die Daten zeigen, daß der adenovirale Gentransfer von rhPlgK1-4, rhPlgK1-5, muthPlgK4 und muthPlgK5 angiostatische und antitumorale Effekte hervorruft und erfolgreich zur Behandlung des experimentellen HCC eingesetzt werden kann. Möglicherweise eröffnet diese Therapieform auch eine potentielle Therapieoption zur Behandlung des HCC am Menschen.