Untersuchungen zur Struktur und Physiologie des hyperglykämischen Hormons (CHH) beim europäischen Flusskrebs, <em>Astacus astacus </em>L.

Abstract

Aus Sinusdrüsen des europäischen Flusskrebses <em>Astacus astacu</em>s (Astacidae), wurde ein CHH (crustacean hyperglycemic hormone) isoliert und mittels Massenspektrometrie, Edman-Sequenzierung und Aminosäureanalyse vollständig sequenziert. <em>Astacus</em>-CHH (8384,18 Da) besteht aus 72 Aminosäureresten und existiert in zwei posttranslational modifizierten Isoformen: L- und D-Phe³-CHH. Der C-Terminus beider Isoformen ist amidiert, der N-Terminus ist durch eine Pyroglutamyl-Gruppe blockiert. Die Aminosäuresequenz des <em>Astacus</em>-CHH weist eine sehr hohe Identität (> 95 %) mit den von amerikanischen Flusskrebsen (Cambaridae) bekannten CHH-Sequenzen auf. Im Glucose-Bioassay zeigte injiziertes CHH einen dosisabhängigen, ausgeprägten hyperglykämischen Effekt. Dieser war bereits bei der niedrigsten Dosis (6,25 pmol/Tier von 100 g Lebendgewicht) hochsignifikant. CHH-Hämolymph-Konzentrationen wurden mit einem ELISA gemessen. Die <em>in-vivo </em>Halbwertszeit des Hormons in der Hämolymphe wurde mit 1,5-2 min bestimmt. Die Messung von Hämolymph-CHH-Konzentrationen nach Injektion von Glucose lieferte Hinweise auf eine negative Feedback-Kontrolle der CHH-Sekretion. Es ist anzunehmen, dass die CHH-Zellen des X-Organs direkt als Sensoren für die Hämolymph-Glucose fungieren, und dass Glucose über einen noch unbekannten Mechanismus die CHH-Sekretion dieser Zellen in die Hämolymphe reguliert. Des Weiteren untermauert dieser Befund die Bedeutung eines einfachen negativen Feedback-Effektes als allgemein verbreitetem Mechanismus der Regulation der Glucose-Homöostase bei Dekapoden. Nach Injektion von CHH-Antiserum zur Neutralisation des endogenen CHH war die erwartete Absenkung des Glucose-Titers durch eine entgegenwirkende Stress-Hyperglykämie nicht direkt nachweisbar. Allerdings war diese unvermeidbare Hyperglykämie bei Injektion von Antiserum (im Vergleich zu Normalserum bzw. Saline) signifikant abgeschwächt. Dies beweist eine zumindest teilweise Neutralisation des endogenen zirkulierenden CHH und gibt damit einen indirekten Hinweis auf eine regulatorische Rolle des normalen CHH-Titers für die Glucose-Hömöostase. Die funktionelle Bedeutung des CHH bei der Anpassung des Stoffwechsels von <em>Astacus astacus</em> an hypoxische Umweltbedingungen wurde bei a) extremer Hypoxie (Haltung an wassergesättiger Luft) und b) partieller Hypoxie (pO₂ 80 mm Hg anstelle von 160 mm Hg) untersucht. Bei partieller Hypoxie ergab sich eindeutig eine Beteiligung von CHH bei der Stoffwechseladaption. Nur bei intakten Tieren war ein Anstieg der CHH-Konzentrationen und eine Laktatakkumulation in der Hämolymphe nachweisbar. Bei augenstiellosen Tieren erfolgte keine Laktatakkumulation in der Hämolymphe, was jedoch durch die Injektion von CHH kompensiert werden konnte. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Hypoxie-induzierte Sekretion von CHH durch Mobilisation von Glucose für die Adaption der Tiere an einen teilweise anaeroben Stoffwechsel von Bedeutung ist. Studien an Häutungstieren zeigten eine natürlich auftretende, physiologische Hypoxie während der Ecdysis, messbar durch eine starke Laktatakkumulation in der Hämolymphe. Die Laktat-Titer waren von der späten Ecdysisphase bis etwa 0,5 h nach Vollendung der Ecdysis erhöht, wurden aber schnell, meist innerhalb von 2 h wieder abgebaut. Die CHH-Messungen ergaben einen dramatischen, kurzzeitigen CHH-Peak kurz vor bzw. mit Beginn der Häutung. Die Maximalwerte betrugen 460-510 fmol/100 µl (basale Werte: 1,5-4,5 fmol/100 µl). Zum Vergleich: unter anderen Stressbedingungen wurden niemals Werte über 9-10 fmol/100 µl gemessen. Etwa 30-60 min nach Ende der Ecdysis fielen die CHH-Titer stark ab und näherten sich langsam den Basalwerten, die spätestens nach 20 h erreicht wurden. Da die Experimente nicht auf eine direkte Beteiligung von CHH an einer Stoffwechseladaption an die natürliche Hypoxie hinwiesen, ist das CHH-Signal als Hinweis auf eine andere biologische Funktion zu werten. Studien zur Identifizierung von CHH-Zielgeweben anhand von second-messenger Reaktionen führten zum Nachweis signifikanter Erhöhungen der cGMP-Gehalte in Gehirn, Antennendrüse, Kiemen, Herz und Schwanzmuskel nach Injektion von reinem CHH (5-50 pmol/Tier, 15-18 g Lebendgewicht). Somit wurden diese Gewebe eindeutig als Zielorgane identifiziert. Deutliche, wenngleich statistisch nicht signifikante Befunde wiesen auch auf Hepatopankreas und Abdominalganglien als Zielorgane hin. Eine Beteiligung von cAMP an der CHH-Wirkung konnte nicht eindeutig gezeigt werden.

<strong>Studies on structure and physiology of the crustacean hyperglycemic hormone (CHH) from the Euroean crayfish, <em>Astacus astacus</em> L.</strong><br /> From sinus glands of the European crayfish <em>Astacus astacus</em> (Astacidae) a CHH (crustacean hyperglycemic hormone) was isolated and fully characterized by mass spectrometry, Edman sequencing and amino acid analysis. <em>Astacus</em>-CHH (8384,18 Da) consists of 72 amino acid residues and exists in two posttranslational modified isoforms: L- and D-Phe³-CHH. Both isoforms are characterized by C-terminal amidation and pyroGlu as a N-terminal blocking group. Sequence alignment revealed high sequence identity (> 95 %) of <em>Astacus</em>-CHH with known CHHs of American crayfish species (Cambaridae). In the hemolymph glucose bioassay, injected CHH (lowest dose: 6,25 pmol/animal of 100 g live weight) showed a dose-dependent, very potent hyperglycemic effect. Hemolymph-CHH was quantified by an ELISA. Its i<em>n vivo</em> half-life was determined to be between 1.5-2 min. Evidence for a negative feedback control of CHH-release in vivo was obtained by measurement of hemolymph CHH levels after injection of glucose. It can be assumed that the CHH-cells of the X-Organ act as glucose sensors and therefore enable glucose to regulate release of CHH into the hemolymph. This simple negative feedback effect may be a general mechanism for the control of glucose homoeostasis in decapods. Neutralization of circulating CHH <em>in vivo</em> by antiserum did not directly result in the expected decrease of the glucose level. However, hyperglycemia induced by the unavoidable handling stress was significant diminished after injection of antiserum compared with normal rabbit serum and saline. This shows at least partial neutralization of endogenous circulating CHH and gives indirect evidence for a regulatory role of the normal CHH titer in glucose homoeostasis. A possible role of CHH in endocrine metabolic adaptation to hypoxic environmental conditions was studied in animals under a) extreme hypoxia (animals emersed) and b) partial hypoxia (pO₂ 80 mm Hg instead of 160 mm Hg). In case of partial hypoxia an involvement of CHH in metabolic adaptation was observed. Only intact animals displayed an increase of CHH levels and hyperlactaemia. In eyestalk-less animals no hyperlactaemia could be detected. This effect could be reversed by injection of CHH before exposure to hypoxic conditions. Thus it can be concluded, that hypoxia-induced secretion of CHH is important for adaptation of animals to a partially anaerobic metabolism by mobilization of glucose reserves. Studies on molting animals demonstrated a natural physiological hypoxia, as shown by hyperlactaemia, which was associated with ecdysis. During late ecdysis and for about 30 min into early postmolt lactacte levels were elevated, declining within approximately 2 h to normal levels. Measurement of hemolymph CHH revealed a dramatic, short term CHH peak coincident with beginning of ecdysis. From the usual CHH titres of 1.5-4.5 fmole/100 µl, CHH titres increased to 460-510 fmole/100 µl during ecdysis. For comparison: in different stress conditions CHH levels never exceeded 9-10 fmole/100 µl. Within 30-60 min after completion of ecdysis CHH levels strongly declined and had returned to basal values after approximately 20 h. Since the experiments provided no direct evidence for an involvement of CHH in metabolic adaptation to the natural hypoxia during molt, the CHH surge can be considered as clue to an additional biological effect of CHH. In studies to identify target tissues of CHH in <em>Orconectes</em> limosus by their cyclic nucleotide responses, injection of pure CHH (5-50 pmole/animal, 15-18 g live weight) resulted in significant elevation of cGMP levels in brain, antennal gland, gills, heart and abdominal muscle, which consequently were identified as target tissues. Distinct, even though statistically not significant results pointed to hepatopancreas and abdominal nerve cord as target tissues as well. Involvement of cAMP in mediation of CHH action could not be shown definitely.