Entwicklung gaschromatographisch-massenspektrometrischer Methoden zur Untersuchung der intestinalen Cholesterinresorption und Bestimmung von Ursodesoxycholsäure sowie deren Anwendung in klinischen Studien

Abstract

Zur Bestimmung der intestinalen Cholesterinresorption wurde aufbauend auf einer etablierten Methode eine neue gaschromatographisch-massenspektrometrische Methode entwickelt, validiert und in einer klinischen Studie eingesetzt. Im Gegensatz zu der bisher angewendeten Methode zur Ermittlung der Cholesterinresorption ermöglichte die neue Methode die Quantifizierung der neutralen fäkalen Sterole, die zur Berechnung der Sterolresorption notwendig sind. Die Methode wurde erfolgreich unter Studienbedingungen zur Bestimmung der Cholesterinresorption unter der Therapie von Simvastatin und des Cholesterinresorptionshemmers Ezetimib eingesetzt. Die Ergebnisse der Studie zeigten eine höchstsignifikante Reduktion der Cholesterinresorption unter Ezetimib-Monotherapie um ca. 41 % gegenüber Placebo und ebenfalls eine höchstsignifikante Reduktion unter der Kombinationstherapie mit Ezetimib und Simvastatin von ca. 42 % gegenüber Placebo. Ein signifikanter Anstieg der Cholesterinresorption von ca. 4 % gegenüber Placebo konnte in der Behandlungsphase mit Simvastatin ermittelt werden.<br /> Cholesterinbiosynthese und Cholesterinresorption verhielten sich nahezu gegenläufig und die Ergebnisse zeigten, daß aufgrund der verminderten Cholesterinresorption unter der Therapie mit Ezetimib eine gesteigerte Biosynthese vorliegt. Durch den kombinierten Einsatz von Cholesterinresorptionshemmer und Statin konnte die unter Ezetimib gesteigerte Synthese reduziert werden. <br /> Die Quantifizierung der Analyten ermöglichte einen prozentualen Vergleich der Mengen der Analyten in den unterschiedlichen Behandlungsphasen. Es zeigten sich in allen Behandlungsphasen sehr einheitliche, gleichbleibende Werte für die Analyten d₆-Coprostanol bzw. d₆-Cholesterin, wodurch eine Änderung im Metabolisierungsverhalten der Darmbakterien in den jeweiligen Behandlungsphasen ausgeschlossen werden kann.<br /> Auch die Menge des intestinalen Flow-Markers d₄-Sitostanol wurde in den unterschiedlichen Behandlungsphasen quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten eine sehr konstante Menge des Flow-Markers über alle vier Behandlungsphasen. Damit konnten Ergebnisse früherer Untersuchungen bestätigt werden, wonach d4-Sitostanol als verläßliche Markersubstanz in der Bestimmung der intestinalen Cholesterinresorption genannt und eingesetzt wurde. <br /> Es ist anzunehmen, daß die neue Methode zukünftig bei stabiler Deuteriummarkierung der eingesetzten Markersubstanzen ebenso zur Bestimmung der Resorption der beiden Phytosterole Sitosterin und Campesterin eingesetzt werden kann. <br /> Der Vergleich der von Lütjohann entwickelten Methode mit der in dieser Arbeit entwickelten Methode zeigte eine ausgezeichnete Korrelation. Im Gegensatz zu der bisher angewandten Methode ist die neue Methode nach internationalen Leitlinien validierbar. Mit der Validierung konnte nachgewiesen werden, daß die Messungen den allgemein geforderten Qualitätskriterien nach GLP entsprechen, und die Methode zur Bestimmung neutraler fäkaler Sterole im Rahmen der Untersuchung der Cholesterinresorption geeignet ist. <br /> Des weiteren wurde in dieser Arbeit eine gaschromatographisch-massenspektrometrische Methode zur Bestimmung von Ursodesoxycholsäure in humanem Plasma entwickelt. Diese wurde zur Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von Ursodesoxycholsäure eingesetzt, um Erkenntnisse über den Einfluß unterschiedlicher Lagerungsbedingungen auf die Stabilität des Arzneistoffes im Plasma zu gewinnen. Die Untersuchung belegte die Stabilität des Analyten bei verschiedenen für den Probentransport und die Probenlagerung relevanten Temperaturen und Lagerungszeiträumen. <br /> Der Nachweis der Stabilität von Ursodesoxycholsäure bildete Grundlage und Voraussetzung für die nachfolgende Bioäquivalenzstudie zweier Arzneimittelzubereitungen mit Ursodesoxycholsäure. Für die Bioäquivalenzstudie wurden Konzentrations-Zeit-Profile von 24 Probanden nach Einnahme der Ursodesoxycholsäure-Testformulierung (Tablette à 500 mg UDCA) und nach Einnahme der Referenzformulierung (zwei Kapseln à 250 mg Ursodesoxycholsäure) mit der in dieser Arbeit entwickelten gaschromatographisch-massenspektrometrischen Methode erstellt. Die Bioäquivalenz wurde aus diesen Profilen von einem unabhängigen Dienstleistungszentrum (SocraTec R&D GmbH, Oberursel) ermittelt. Cmax und AUC0-tlast erfüllten die im Studienplan festgelegten Akzeptanzkriterien mit einem 90 %-Konfidenzintervall für C_max von 73-100 % und für AUC_0-tlast von 98-116 %. Jedoch bemängelte die deutsche Zulassungsbehörde (BfArM) die im Vorfeld der Studie festgelegten Akzeptanzkriterien für C_max als zu weit ausgelegt (90 %-Konfidenzintervall von 70-143 %) und forderte deshalb die Durchführung einer weiteren Studie mit den üblichen Akzeptanzkriterien für C_max und AUC_0-tlast (90 %-Konfidenzintervall 80-125 %). Somit steht die abschließende Entscheidung der deutschen Zulassungsbehörde über Zustimmung oder Ablehnung des Zulassungsantrages noch aus.