Schwarzer, Sarah: Funktionelle Expression und Analyse von K+-Kanälen aus Säugern in Saccharomyces cerevisiae. - Bonn, 2006. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-08070
@phdthesis{handle:20.500.11811/2638,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-08070,
author = {{Sarah Schwarzer}},
title = {Funktionelle Expression und Analyse von K+-Kanälen aus Säugern in Saccharomyces cerevisiae},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2006,
note = {Es wurde untersucht, inwieweit sich S. cerevisiae als System eignet, in dem verschiedene K+-Kanal-Gene aus Säugern exprimiert und die Genprodukte analysiert werden können. Es wurde die Expression verschiedener K+-Kanal-Gene (Auswärts-gleichrichter: KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, rEAG1 (-Varianten), Einwärts-gleichrichter: Kir2.1 (-Mutanten), Kir3.2 (-Mutanten)) und die Funktionsfähigkeit der entsprechenden Proteinprodukte in S. cerevisiae untersucht.
Die Expression der Gene und die Lokalisation der Genprodukte wurde mit Hilfe von GFP-Fusionskonstrukten überprüft. So konnte gezeigt werden, dass ein Transport von rEAG1/yEGFP und rEAG1Δ190/yEGFP in die Plasmamembran erfolgte. Andere untersuchte K+-Kanal/yEGFP Fusionsproteine (hKCNQ2/yEGFP, hKCNQ3/yEGFP, yEGFP/mKir2.1 (-Mutanten), yEGFP/rKir3.2 (-Mutanten) und yEGFP/hKCNE3 bzw. hKCNE3/yEGFP) wurden zum großen Teil in Kompartimenten wie dem ER oder dem Golgi-Apparat zurückgehalten. Untersuchungen von Deletions- und Mutations-Varianten von hKCNE3, yEGFP/hKCNE3ΔC und yEGFP/hKCNE3 ASA, zeigten, dass diese Fusionsproteine in der Plasmamembran lokalisiert waren. So wurde das Tripeptid RSR im C-terminalen Bereich von hKCNE3 als ein in Hefe wirksames ER-Retentionssignal identifiziert.
Grundlage der funktionellen Tests war die Verwendung eines Hefestamms dem die endogenen K+-Translokationssysteme fehlen (Δtrk1,2 Δtok1) und der deshalb kaum in Medium mit niedriger KCl-Konzentration wächst. Getestet wurde, ob die Präsenz eines heterologen K+-Kanals zu verbesserten Wachstum in Medium mit niedriger KCl-Konzentration führt.
Es wurden heteromere K+-Kanäle der KCNQ-Familie untersucht, die jedoch auch einen Einwärtsstrom vermitteln können. Weder bei KCNQ2 bzw. hKCNQ3 alleine noch hKCNQ2 und KCNQ3 gemeinsam exprimierenden Stämmen konnte jedoch im Vergleich zum Kontrollstamm (yEGFP exprimierende Tripelmutante) verbessertes Wachstum in Medium mit niedriger KCl-Konzentration festgestellt werden. Auch die Koexpression von KCNQ1- und KCNE3-Untereinheiten die einen konstitutiv offenen K+-Kanal bilden, führte in Hefe nicht zu verbesserten Wachstum gegenüber dem Kontrollstamm in Medium mit niedriger KCl-Konzentration.
Untersuchungen von rEAG1, rEAG1Δ190 und rEAG1-Mutanten zeigten ein minimale Wachstumsverbesserung des rEAG1 exprimierenden Stammes in Medium mit niedriger KCl-Konzentration gegenüber dem Kontrollstamm beobachtet. Bei rEAG1Δ190, der schon bei weniger depolarisierter Membran öffnet, war dieser Effekt stärker ausgeprägt.
Für Kir2.1 war die funktionelle heterologe Expression in S. cerevisiae schon beschrieben. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag hier auf solchen Kir2.1-Mutanten, die Ursache des Andersen-Syndrom sind. Erstmals konnte mit S. cerevisiae als Expressionssystem gezeigt werden, dass die vom Kir2.1-Wildtyp verursachte Wachstumsverbesserung K+-Aufnahme defekter Hefezellen in Medium mit wenig K+ durch Koexpression mit nicht funktionellen mKir2.1-Mutanten (mKir2.1 [D71V], [S136F]} bzw. [G144S]) wieder aufgehoben wird. Diese drei nicht funktionellen Mutanten haben somit sehr wahrscheinlich einen dominant negativen Effekt auf die Kir2.1 Funktion.
Desweiteren wurde mit Kir3.2 ein G-Protein aktivierter K+-Kanal untersucht. Die Expression von Kir3.2-Mutanten, welche ohne G-Protein Bindung eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit aufweisen, führte zu verbessertem Wachstum in Medium mit niedriger KCl-Konzentration. Die bekannte reduzierte K+-Selektivität der Kir3.2 [S177W] Mutation, konnte ebenfalls im Hefesystem nachgewiesen werden.
Pharmakologische Untersuchungen der Effekte von Ba2+- und Hygromycin B auf Kir3.2 (-Mutanten) zeigten, dass S. cerevisiae als Expressions- und Testsystem für Kir3.2-Kanäle geeignet ist. Es konnte gezeigt werden, dass Na+ im Medium zu verbessertem Wachstum des den Kir3.2 Wildtyp exprimierenden Stamms führt. Damit konnten Bedingungen definiert werden bei denen auch ohne Bindung eines G-Proteins die Offenwahrscheinlichkeit von Kir3.2 erhöht ist und somit die Untersuchung dieses Kanals in S. cerevisiae möglich wird.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/2638}
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