Extra- und intrazelluläre Laccasen der acidophilen schwarzen Hefe <i>Hortaea acidophila</i>

Abstract

<i>Hortaea acidophila</i>, die aus einem Medium mit pH 0,6 isoliert wurde, gehört zur ascomycetischen Ordnung der Dothideales und bildet Melanin, weshalb zu Beginn der vorliegenden Arbeit das Vorliegen einer Laccase in diesem Organismus postuliert wurde. Laccasen sind oxidative Enzyme und in der Lage verschiedenste Substrate (u.a. Polyphenole) zu nutzen. Als terminaler Elektronenakzeptor fungiert Sauerstoff Die Hypothese über das Vorliegen einer Laccase konnte insofern bestätigt werden, als unter den gewählten Bedingungen in Kulturüberstand, Zellextrakt und zellassoziiert drei verschiedene aktive Laccasen in <i>H. acidophila</i> nachgewiesen werden konnten. Insbesondere das intrazelluläre Enzym erwies sich aufgrund der hohen Säuretoleranz als besonders interessant. <br /> Durch eine Optimierung der Wachstumsbedingungen wurde zunächst die Wachstumszeit halbiert und die Laccaseaktivitäten wurden u.a. durch eine Induktion mittels Kupfersulfat um das bis zu 70fache gesteigert. Unter Verwendung eines spektrophotometrischen Verfahrens mit ABTS sowie nach SDS-PAGE mit Dihydroxynaphthaline als Substrat wurden Laccaseaktivitäten im Kulturüberstand, asssoziiert mit den Zellen und im Zellextrakt nachgewiesen. Um die Laccasen zu isolieren, aufzukonzentrieren und aufzureinigen, wurden verschiedene Methoden zu Ultrafiltration, Zellaufschluss, Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatographie optimiert. Da das in fast allen Extrakten enthaltene Melanin ein Störfaktor für viele Methoden (Spektrophotometer, Gelelektrophorese u.a.) war, bestand ein großer Teil der vorliegenden Arbeit in der Eliminierung der Melaninkomponente aus den Proben, was durch Gelfiltration der Proben mit EconoPac 10 DG bis zu 80% erreicht wurde. Eine Lokalisationsbestimmung der Laccasen mittels Aktivitätstest in der SDS-PAGE bzw. Immunhybridisierung der Laccasen aus den verschiednen Extrakten im Western-Blot ergab, dass <i>H. acidophila</i> mindestens drei, möglicherweise vier verschiedene aktive Laccasen bildet: L (85), L (70) und L (55) sowie evt. L (130). Dabei lag L (85) aktiv im Zellextrakt vor und L (70) wurde im Kulturüberstand nachgewiesen. L (55) war mit den <i>H. acidophila</i> Zellen assoziiert und konnte von diesen abgewaschen werden. L (55) konnte als Kontamination auch im Kulturüberstand und im Zellextrakt nachgewiesen werden. Die Laccasen wurden in einem drei Schritte umfassenden Reinigungsprotokoll partiell und im Falle von L(55) aus dem Zellextrakt homogen aufgereinigt. Als Methoden wurden hierbei Ultrafiltration, Gelfiltration und Kationenaustauschchromatographie genutzt. Eine Aufreinigung von L (85) aus dem Zellextrakt war mit diesen Methoden nicht möglich, da es nicht zu einer Bindung dieser Laccase an einen der Ionenaustauscher kam. N-terminale Aminosäuresequenzen erlaubten die Zuordnung der Laccase L (70) zu Lacc1 (Tetsch, 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde mit L (85) erstmals eine intrazelluläre Laccase in einem Ascomyceten beschrieben. Diese Laccase zeigte darüber hinaus ein ungewöhnlich niedriges pH-Optimum (pH 1,5 mit DMOP) und eine Stabilität über den gesamten sauren Bereich. Das niedrige pH-Optimum macht eine Lokalisation im Cytosol unwahrscheinlich. Man kann davon ausgehen, dass sich die Laccase in melanosomen-ähnlichen Vesikeln befindet, wo das Melanin synthetisiert wird, bevor es zur Zellwand transportiert wird. Bei dieser Melaninsynthese handelt es sich um einen für die Ordnung Dothideales typischen Vorgang, da er sowohl in C. carionii als auch in A. pullulans beschrieben ist. Da die Enzymkonzentrationen insgesamt sehr gering waren, ist für weitere Arbeiten eine Überexpression der Laccasen sinnvoll, wenn die Enzyme für industrielle Applikationen genutzt werden sollen.