Immuntoxinproduktion in Pflanzen

Abstract

Immuntoxine bergen ein großes Potenzial in der Therapie des Hodgkin Lymphoms. Als Zielantigene können hier CD25 und CD30 gewählt werden, welche beide auf den entarteten Reed-Sternberg-Zellen überexprimiert werden. Die murinen Antikörper RFT5 und Ki-4 können spezifisch an diese Oberflächenmarker binden. Es wurden Fusionsgene hergestellt, die die Gene der einzelsträngigen Varianten RFT5(scFv) und Ki-4(scFv) durch Kopplung mit den Genen der Toxindomänen Angiogenin, Granzym B und RTA-N97A verbinden. Auf diese Weise wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene neue Immuntoxinfusionsgene konstruiert. Diese wurden auf genetischer Ebene in ein neu entworfenes Kassettensystem integriert. Dieses ermöglicht den einfachen Austausch aller an der Expression der Gene beteiligten Elemente und der einzelnen Genfragmente selbst. Diese Neuerung ist als wesentliche Vereinfachung für aufbauende Klonierungsarbeiten zu sehen, die eine schnelle Anpassung an wechselnde Ansprüche gewährleistet.<br /> Um eine ökonomische Produktion von wirkungsvollen Immuntoxinen zu ermöglichen, müssen geeignete Produktionssysteme gefunden werden. Pflanzen können posttranslationale Modifizierungen an Proteinen durchführen und weisen niedrige Haltungskosten auf. Somit könnten diese ein ideales Produktionssystem darstellen. In dieser Arbeit wurde die Eignung von Tabak (Nicotiana tabacum) und Zwerglinsen (Wolffia australiana und Wolffia brasiliensis) zur Produktion von Immuntoxinen getestet. Mittels A. tumefaciens-vermittelter Transformation wurde beispielhaft ein Immuntoxingen, welches für ein Fusionsprotein mit Angiogenin am N-Terminus und RFT5(scFv) am C-Terminus codiert, in die Pflanzen gebracht. Das Gen konnte nach der Transformation im Genom mehrerer Tabakpflanzen detektiert werden. Auch eine Transkription des Immuntoxingens war nachweisbar. Der stabile Einbau und die Vererbung des Fremdgens konnten durch die Erzeugung einer transgenen F1-Generation bestätigt werden. Auch hier konnte das Gen auf DNA- und mRNA-Ebene nachgewiesen werden. Das Immuntoxin selbst konnte in geringen Konzentrationen im Zellextrakt gefunden werden. Es erwies sich jedoch als instabil. In den Zwerglinsen konnten bereits bestehende Transformations- und Selektionsprotokolle weiterentwickelt und optimiert werden. Auf diese Weise konnte in Wolffia australiana ebenfalls eine Expression des Immuntoxingens nachgewiesen werden. Somit konnten im Verlauf dieser Forschungsarbeit erstmals Immuntoxingene in ganzen Pflanzen exprimiert werden. Die Daten dieser Arbeit bilden somit die Basis zu einer Etablierung dieser innovativen Produktionsmethode von Immuntoxinen.