Entwicklung von automatisierten und skalierbaren Verfahren zur Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wurden Verfahren zur automatisierten und zur skalierbaren Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen (hES Zellen) erarbeitet. Hierfür wurde zunächst die manuelle humane ES Zellkultur in Gegenwart von Fibroblasten sowie unter Verwendung Fibroblasten-konditionierten Mediums etabliert. Die hierbei gewonnenen Erfahrungen bildeten die Grundlage für die Entwicklung eines automatisierten Systems für die murine und die humane ES Zellkultur, die in Kooperation mit Hamilton Life Science Robotics durchgeführt wurde. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass ein automatisiertes System dafür geeignet ist, mES und hES Zellkulturen über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten, ohne die Proliferation oder das <i>in vitro</i>-Differenzierungspotenzial dieser Zellen zu beeinflussen. Die mittlere spezifische Wachstumsrate von über vier Wochen automatisiert kultivierten ES Zellen war mit 0,72 ± 0,06d^-1 für mES Zellen bzw. mit 0,22 ± 0,003d^-1 für hES Zellen vergleichbar zu der manuell kultivierter Zellen. 96 ± 2% der mES Zellen und 96 ± 1% der hES Zellen zeigten im Anschluss an diesen Kultivierungszeitraum eine Expression des Pluripotenz-assoziierten Markers Oct-4. Für das Oberflächenantigen SSEA-1 waren 94 ± 2% der Zellen in mES Zellkulturen immunreaktiv. hES Zellkulturen wiesen eine stabile Tra-1-60- (87 ± 4%) und Tra-1-81-Expression (89 ± 2%) auf. Der Karyotyp der automatisiert kultivierten hES Zellen blieb stabil. Des Weiteren wurde in dieser Dissertation ein skalierbarer Prozess zur Microcarrier-basierten Suspensionskultur humaner ES Zellen entwickelt. Unter Verwendung des Carriers Cytodex3 sowie eines Glasballrührers bei einer Rührerdrehzahl von 20rpm und Intervallrühren konnten mittlere spezifische Wachstumsraten von 0,34 ± 0,02d^-1 erreicht werden. Diese Wachstumsrate ist mit der konventioneller Monolayerkulturen (0,26 ± 0,09d^-1) mindestens vergleichbar. Über diesen Prozess konnte eine Zellpopulation gewonnen werden, die die Expression Pluripotenz-assoziierter Marker sowie ihr <i>in vitro</i>-Differenzierungspotenzial aufrechterhielt. Strategien zur Optimierung dieses Prozesses wurden entwickelt. Insgesamt demonstriert diese Arbeit, dass es möglich ist, humane ES Zellen bei Erhalt ihrer charakteristischen Eigenschaften unter automatisierten Bedingungen sowie über skalierbare Verfahren zu expandieren. Die in dieser Arbeit entwickelten Verfahren stellen eine Grundlage für die Entwicklung ES Zell-basierter Screeningsysteme dar. Ein skalierbarer Prozess für die standardisierte Produktion großer Zahlen an hES Zellen wäre dafür geeignet, das Ausgangsmaterial für kontrollierte Differenzierungsprozesse zur Verfügung zu stellen. Diese Differenzierungsverfahren könnten in Zukunft mit Hilfe eines automatisierten Zellkultursystems deutlich besser standardisiert werden. Die Automatisierung würde es zudem erlauben, ES Zell-abgeleitete somatische Zellen im Mikrotiterplatten-Format zu plattieren und der pharmazeutischen Industrie in validierter Form zur Verfügung zu stellen. hES Zell-abgeleitete somatische Zellpopulationen könnten es in Zukunft erlauben, die Wirksamkeit neu entwickelter Pharmaka direkt an humanen Zellen zu evaluieren, die nicht nur den Phänotyp des betroffenen Gewebes repräsentieren, sondern auch molekulare Charakteristika der betreffenden Erkrankung widerspiegeln.