Charakterisierung der Dlk/CDC5 Interaktion und der Genstruktur des <i>Dlk</i> Gens

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion des Spleißfaktors CDC5 und der Dlk (DAP like Kinase) durch proteinbiochemische und zellbiologische Methoden untersucht. Zunächst wurde die komplette cDNA von CDC5 mit Hilfe der PCR aus einer cDNA-Bibliothek der Ratte isoliert. Die Interaktion von CDC5 und der Dlk wurde durch <i>in-vitro</i> Bindungsanalysen und <i>in-vivo</i> Kolokalisationsanalysen verifiziert. Als Interaktionsdomänen bezüglich der Dlk/CDC5 Interaktion wurden mit Hilfe des <i>Yeast-Two-Hybrid</i> Systems der Leuzin-Zipper der Dlk und der C-terminale Bereich von CDC5 zwischen den Aminosäureresten 500 und 802 identifiziert. Phosphorylierungsanalysen zeigten, das CDC5 zumindest <i>in-vitro</i> kein Substrat der Dlk ist. Vielmehr wurde CDC5 durch eine Mitaufgereinigte Kinase, die anschließend als CK2 identifiziert wurde, phosphoryliert. Für den aktiven Kerntransport von CDC5 konnte ein funktionelles NLS (NLS 4)</nobr> und 3 putative NLSs (NLS 1 3)</nobr> identifiziert werden. Mit Hilfe von CDC5-Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass CDC5 Homodimere sowie mit der Dlk Heterodimere bilden kann. Beide Proteine kolokalisieren perfekt in nuklearen <i>„speckles“</i>, die wiederum teilweise deckungsgleich sind mit PML-<i>„bodies“</i>. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass der nukleare Spleißfaktor SC35 durch eine transiente Überexpression von CDC5 oder der Dlk in das Cytoplasma verdrängt wird. Mit Hilfe von <i>Caspase 2</i></nobr> Mini-Gen Spleiß-Analysen konnte gezeigt werden, dass diese Verdrängung von SC35 zu einer erhöhten Expression des antiapoptotischen alternativen Spleißprodukts Caspase 2L führt. In Phosphorylierungs-analysen wurde ASF/SF2 bzw. SC35, beides Proteine des CDC5-Komplexes des Spleißosoms, als ein starkes bzw. schwaches Substrat der Dlk identifiziert.<br /> Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der transkriptionell regulierende Bereich des <i>Dlk</i>-Gens isoliert. Es konnte ein funktioneller Core-Promotor und Enhancer sowie verschiedene CCAAT Boxen und potentielle Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (Elk-1, NF-1/NF-Y, CREB, COMP1), sowie ein SRE und ein Ras RE identifiziert werden. Vergleichende Strukturanalysen des <i>Dlk</i>-Gens des Menschen, der Maus und der Ratte zeigten eine identische Exon/Intron Struktur in allen drei Spezies. Auch die Größe der kodierenden Exons für die Kinasedomäne der Dlk und weiterer Mitglieder der DAP-Kinase Familie (DAPK1 und DAPK2) sind nahezu identisch und scheinen während der Evolution hochkonserviert zu sein. Mit den Sequenzdaten des <i>Dlk</i>-Gens aus der Maus konnte eine Klonierungsstrategie eines Targeting-Vektors für einen generellen induzierbaren Dlk knock-out in der Maus erstellt und ein das <i>Dlk</i>-Gen der Maus enthaltender Cosmid Klon isoliert werden.