Enzymatische Decarboxylierung von Benzenpolycarbonsäuren

Abstract

1. Ziel der Arbeit<br /> In diesem Dissertationsvorhaben sollten bakterielle Benzenpolycarbonsäure-Decarboxylanten isoliert und die zugehörigen Decarboxylasen untersucht werden. Hierfür war es zwingend erforderlich, Methoden zur Reinigung dieser bislang völlig unbekannten Enzyme zu etablieren. <br /> 2. Methoden<br /> Durch mikrobiologische Arbeitsschritte wurden Mikroorganismen isoliert und differenziert werden, welche über das gesuchte Enzym bzw. die gesuchten Enzyme verfügen. Darüber hinaus wurde die Verwertung verschiedener Benzencarbonsäuren (BCS) durch unterschiedliche Mikroorganismen vergleichend untersucht werden. In biochemischen Experimenten wurden Methoden entwickelt und angewendet, mit deren Hilfe eine solche BCS-Decarboxylase gereinigt und eindeutig nachgewiesen werden konnte. Die enzymatischen Decarboxylierungsschritte zur Einleitung des Abbaus verschiedener BCS wurden mittels hoch auflösender Flüssigchromatographie (HPLC) dokumentiert.<br /> 3. Ergebnisse und Schlussfolgerung<br /> Es gelang die Anzucht von insgesamt 22 selbst isolierten Bakterienstämmen mit Benzen-1,2,4,5-tetracarbonsäure (Pyromellitsäure) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle. Mit dem im Rahmen dieser Dissertation isolierten Bakterienstamm „Artern“ konnte eine neue Bakterienart entdeckt und erstmalig beschrieben werden, die wahrscheinlich eine neue Gattung innerhalb der alpha-Proteobakterien repräsentiert. Erstmals gelang der Nachweis des mikrobiellen Wachstums mit Benzenpentacarbonsäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durch den neu isolierten Stamm „Artern“ und andere Bakterien. Mittels HPLC wurde die Einleitung des Abbaus der Benzenpentacarbonsäure durch zweifache enzymatische Decarboxylierung nachgewiesen und dabei die intermediäre Bildung zweier unterschiedlicher Benzentetracarbonsäuren durch verschiedene Bakterienstämme beobachtet. Durch einen in dieser Arbeit entwickelten Enzymtest kann die enzymatische Decarboxylierung von Benzenpentacarbonsäure nun spektralphotometrisch quantifiziert werden. Mellitsäure konnte mit hoher Effizienz (ca. 50% d. Bindungsstellen) an EAH Sepharose 4B gekoppelt und somit ein neuartiges Material zur Liganden-Affinitätschromatographie (LAC) hergestellt werden. Mit Hilfe dieser neu entwickelten LAC gelang die weltweit erste Reinigung einer Benzenhexacarbonsäure- (Mellitsäure-) Decarboxylase (MDCase) aus dem selbst isolierten Bodenbakteriums LFG19a (Sinorhizobium morelense/Ensifer adhaerens). Durch eine neu entwickelte Aktivitätsfärbung konnte das mutmaßliche Monomer als aktive Form der MDCase nachgewiesen werden. Hierbei wurde außerdem endgültig bewiesen, daß dieses Enzym unabhängig von Cofaktoren arbeitet. Bei Anzucht des Bakterienstammes LFG19a mit Mellitsäure, Benzenpentacarbonsäure, Pyromellitsäure und Benzen-1,2,4-tricarbonsäure wird unabhängig von der Kohlenstoffquelle jeweils eine identische MDCase exprimiert. Mellitsäure und Benzenpentacarbonsäure werden in LFG19a durch dasselbe Enzym decarboxyliert. Für die Decarboxylierung der Pyromellitsäure wird in diesem Stamm eine weitere Decarboxylase benötigt; diese wird bei Wachstum mit Benzen-1,2,4-tricarbonsäure nicht exprimiert. Mit der MDCase aus LFG19a wurde das erste Enzym überhaupt isoliert, das zwei Carboxylgruppen von einem Aromaten abspaltet.