Der Einfluss von Konstituenten der extrazellulären Matrix und motogener Mediatoren auf Parameter der epithelialen Migration

Abstract

Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die Erkenntnis, dass die wichtigsten Migrationsparameter eine Abhängigkeit von der Konzentration von Fibronektin als Adhäsions- und Migrationssubstrat zeigen (Borm et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit wurden der Einfluss weiterer ECM Substrate untersucht und die Filopodien als neuer wichtiger Migrationsparameter identifiziert und definiert. Zusätzlich wurden die Motogene EGF und TGF-ß1 in ihrer Wirkung auf die Ausbildung von Filopodien charakterisiert.<br /> Mit Hilfe des „Live Cell Imaging“ wurde gezeigt, dass Länge, Zahl und Dichte der Filopodien bei humanen epidermalen Keratinocyten substratabhängig sind. Bei allen Filopodien-Parametern ergaben sich für Laminin signifikant höher Werte als für Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV. Eine klare Konzentrationsabhängigkeit konnte dagegen für keines der verwendeten Substrate ermittelt werden. Durch Korrelation der Filopodiendynamik mit anderen Motilitäts-Parametern konnte zudem ein eindeutiger Zusammenhang zwischen Länge und Zahl der Filopodien und derEffizienz von Lamellen-Adhäsion und Zellmigration dargestellt werden. Wir schließen daraus, dass eine hohe Zahl langer Filopodien ein Indikator für geringe Zell-Substrat-Adhäsion und zugleich für ineffiziente Migration ist. Anhand der Messungen an fixierten Zellen konnte gezeigt werden, dass die verwendeten motogenen Wachstumsfaktoren EGF und TGF-ß1 einen positiven Einfluss auf die Filopodienlänge bei Keratinocyten haben, während sie reduzierend auf die Filopodiendichte wirken. Basierend auf den durchgeführten REM Untersuchungen konnte eine Klassifizierung in kürzere (0,1 – 2,5 µm) Filopodien mit unverzweigter Basis und längere (2,7 – 12 µm) Filopodien mit verzweigter Basis vorgenommen werden, die vermutlich frühen, beziehungsweise späten Stadien der Filopodien-Genese entsprechen. Beide Filopodien-Typen ließen sich aufgrund ihrer Dichte (0,05/µm) eindeutig von den ebenfalls fingerförmigen „Retracting Fibers“ (2,21/µm) unterscheiden, was bei der geplanten automatisierten Erfassung von Filopodien hilfreich sein wird.<br /> Basierend auf der Quantifizierung der Länge des „Migration Tracks“ konnten dagegen keine Unterschiede in der Migrationseffizienz bei verschiedenen Substraten und Substratkonzentrationen festgestellt werden und alle Zellen hatten während des Beobachtungszeitraumes von 24 h annähernd die gleichen Strecken zurückgelegt. Keratinocyten können somit offensichtlich auf verschiedenen Substraten effizient migrieren. Die Dichte und Verteilung der ß1-Integrin Makroaggregate deutet jedoch auf Unterschiede in der Adhäsionsstärke und somit auch auf Unterschiede in der Mechanik des „Rear Detachement“ hin. In Zukunft wäre für genauere Studien der Adhäsivität und der beteiligten Mechanismen auch ein Quantifizierung anderer Integrine wie ß3 in der Migrationsspur anzustreben.<br /> Unabhängig vom Substrat synthetisieren und sezernieren Keratinocyten in Kultur Fibronektin, Laminin und Kollagen IV, was für eine für eine weitgehende Unabhängigkeit der Keratinocyten-Migration vom Substrat spricht, die „in situ“ vermutlich entscheidend für die effiziente Reepithelialisierung unter variablen Wundbedingungen ist.