Biochemische und funktionale Charakterisierung der Cytohesin-1-Interaktionspartner CYTIP und GRASP

Abstract

Das Integrin LFA-1 ist essentiell für die Adhäsion und Migration der Leukozyten. Cytohesin-1 ist ein direkter Interaktionspartner und positiver Regulator des Integrins LFA-1 und katalysiert den Guaninnukleotid-Austausch an GTPasen der ARF-Familie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion der beiden homologen Cytohesin-Interaktionspartner CYTIP und GRASP untersucht. <br /> Die beiden homologen Proteine GRASP und CYTIP vermitteln gegensätzliche Funktionen in T-Zellen. Während CYTIP die transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors verstärkt, wird diese durch GRASP inhibiert. Die Expression von CYTIP wird bei der T_H1-Differenzierung induziert [Tang et al., 2002], die GRASP-mRNA wird dagegen durch das T_H2-polarisierende Zytokin IL-4, nicht jedoch durch IL-12 induziert. Demnach könnten CYTIP und GRASP bezüglich der Regulation der IL-2-Expression komplementäre Funktionen in T_H1- und T_H2-Zellen ausüben. GRASP besitzt ein typisches ITAM-Motiv, welches in CYTIP nicht konserviert ist. Durch die Stimulation des T-Zell-Rezeptors wird GRASP spezifisch an den beiden Tyrosinen dieses Motivs phosphoryliert. Der inhibitorische Effekt auf die Induktion des IL-2-Promotors ist jedoch unabhängig von der Integrität des ITAM. Bislang war für GRASP nur eine Interaktion mit Cytohesin-2 und -3 bekannt. Mittels Koimmunpräzipitation und intrazellulärer Kolokalisation konnte hier eine Interaktion zwischen GRASP und Cytohesin-1 nachgewiesen werden. GRASP lokalisiert in T-Zellen an der Plasmamembran. Die Plasmamembran-Assoziation wird durch die Stimulation mit dem Phorbolester PMA reduziert, bleibt jedoch in Cytohesin-1-koexprimierenden Zellen erhalten. Dies zeigt, dass GRASP partiell durch Cytohesin-1 an die Plasmamembran rekrutiert wird. <br /> CYTIP wird in humanen PBL nach Phorbolester-Stimulation rasch und annähernd vollständig degradiert. Die Degradation konnte auf eine PKC?- oder PKC?-vermittelte Phosphorylierung zurückgeführt werden. Die Stabilität von CYTIP ist überdies abhängig von Cytohesin-1. Da CYTIP ein negativer Regulator der LFA-1-vermittelten Adhäsion ist, könnte die induzierte Degradation von CYTIP sowie die Kopplung der CYTIP-Expression an Cytohesin-1 eine Rolle bei der Regulation der LFA-1-vermittelten Adhäsion spielen. Die Ubiquitin-Ligase ARD1 interagiert spezifisch mit Cytohesin-1 [Vitale et al., 2000]. Die Expression von CYTIP wird durch die Koexpression von ARD1 reduziert. Demnach könnte ARD1 an der Degradation von CYTIP beteiligt sein und die CYTIP-Ubiquitinierung katalysieren. Der siRNA-vermittelte „knock-down“ der ARD1-Expression resultiert in einer verminderten Adhäsion humaner PBL an immobilisiertes ICAM-1. Dieser inhibitorische Effekt auf die LFA-1-Adhäsion könnte auf eine Stabilisierung von CYTIP zurückzuführen sein. Andererseits könnte auch die Cytohesin-1-katalysierte Aktivierung der ARF-GTPase-Domäne von ARD1 hierbei eine Rolle spielen. <br /> Cytohesin-1 ist für die LFA-1-vermittelte Adhäsion sowie für die LFA-1-Aktivierung erforderlich, da sowohl die Adhäsion an ICAM-1 als auch die Induktion des mit hoher Affinität assoziierten 327C-Neoepitops durch die siRNA-induzierte Reduktion der Cytohesin-1-Expression inhibiert werden. Die Guaninnukleotid-Austauschfaktor-Aktivität der Mitglieder der Cytohesin-Familie ist für die Adhäsion an ICAM-1, nicht jedoch für die LFA-1-Aktivierung erforderlich, da diese durch den Cytohesin-spezifischen Inhibitor Secin H3 nicht inhibiert wird. Durch diese Ergebnisse konnte ein Modell einer dualen Funktion von Cytohesin-1 bestätigt werden, nach dem die Cytohesin-GEF-Funktion zwar für die LFA-vermittelte Adhäsion, nicht jedoch für die konformationsbedingte Aktivierung des Integrins essentiell ist.