Entwicklung eines bakteriellen Stammes zur Produktion des kompatiblen Solutes Mannosylglycerat

Abstract

Bislang können die kompatiblen Solute Mannosylglycerat bzw. Mannosylglyceramid nur in geringen Mengen (bis 1,85 g/l Fermentationsmedium) über das Bakterienmelkverfahren aus <i>Rhodothermus marinus</i> gewonnen werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Konstruktion eines bakteriellen Stamms, der eine industrielle Gewinnung von Mannosylglycerat in größeren Mengen ermöglicht. Hierzu sollte nach dem Vorbild von <i>Halomonas elongata</i> KB2, einem Produktionsstamm für das kompatible Solut Ectoin, ein transportdefekter Mannosylglycerat überproduzierender Stamm von <i>R. marinus</i> hergestellt werden, der aufgrund einer gestörten Regulation der Mannosylglycerat-Synthese Mannosylglycerat ins Medium abgibt. <br /> Zur Identifizierung eines möglichen Mannosylglycerat-Transporters wurden unterschiedliche molekularbiologische Methoden, die funktionelle Komplementierung solutetransportdefizienter <i>E. coli</i> Stämme, die heterologe PCR und die DDRT-PCR angewendet. <br /> Keine der angewandten Methoden führte zur Identifizierung eines Mannosylglycerat-Transporters in <i>R. marinus</i>. Als alternative Strategie zur Etablierung eines bakteriellen Produktionsstamms für das kompatible Solut Mannosylglycerat wurde daher das Einbringen der Mannosylglycerat-Synthesegene in <i>H. elongata</i> erdacht. Diese wurden unter Kontrolle der Promotoren der osmoregulierten Ectoin-Gene gestellt. So konnte eine salzabhängige Expression erfolgen, gleichzeitig wurde die Ectoin-Synthese ausgeschaltet. <br /> Das <i>ectA</i>-Gen (Diaminobuttersäure-Acetyltransferase) aus <i>H. elongata</i> wurde "in-frame" gegen das <i>mgs</i>-Gen (Mannosylglycerat-Synthase) aus <i>R. marinus</i> ausgetauscht. Der resultierende Stamm <i>H. elongata</i> KB10 weist im Vergleich zu KB1 (d<i>ectA</i>) eine nur geringfügig höhere Wachstumsrate auf. Mannosylglycerat konnte in KB10 mittels Dünnschichtchromatographie und HPLC-Analysen nicht nachgewiesen werden. Northern-Analysen und RT-PCR wiesen jedoch verschiedene <i>mgs</i>-Transkripte nach. Die Expression eines löslichen Fusionsproteins aus Mannosylglycerat-Synthase (Mgs) und His₆-tag im Zytoplasma von <i>H. elongata</i> Wildtyp (10 % NaCl) und KB1 (4 % NaCl) wurde durch Western-Analysen bestätigt. Das Fehlen von Mannosylglycerat in KB10 ließ daher vermuten, dass die benötigten Vorstufen der Mannosylglycerat-Synthese in <i>H. elongata</i> KB10 nicht in ausreichender Menge synthetisiert werden. <br /> Zur Bereitstellung der Mannosylglycerat-Synthesevorstufen in <i>H. elongata</i> wurden die Gene <i>PP1776</i> (Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase) und <i>xanA</i> (Phospho-manno-Mutase) aus <i>Pseudomonas putida</i> KT2440 in das Genom von <i>H. elongata</i> KB10 integriert. Die Ectoin-Synthesegene <i>ectBC</i> von <i>H. elongata</i> KB10 wurden mittels homologer Rekombination gegen die <i>P. putida</i> Gene ausgetauscht. In dem resultierenden Stamm <i>H. elongata</i> KB10.1 wurden in RT-PCR und Northern-Analysen Transkripte der drei Fremdgene <i>mgs, PP1776</i> und <i>xanA</i>, darunter ein Gesamttranskript, nachgewiesen. Die Integration der <i>P. putida</i> Gene führt bei fast allen eingesetzten C-Quellen zu einer deutlichen Beschleunigung des Wachstums im Vergleich zu KB10 und KB1. In HPLC-Analysen konnte daraufhin Mannosylglycerat im Zellextrakt von KB10.1 nachgewiesen werden. Unter Verwendung von Mannose wurde in der früh-stationären Wachstumsphase mit 27,16 mg/g TG der höchste Mannosylglycerat-Gehalt akkumuliert.