<i>In vitro </i>Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Precursors of the Central Nervous System

Abstract

Human embryonic stem cells with the property of pluripotency and unlimited selfrenewal are a promising tool for basic research and future transplantation strategies. Following the establishment of basic techniques of human ES cell cultivation, 2 different strategies for the generation of human embryonic stem cell (human ES cell)-derived neural precursor cells were established.<br /> Protocols for the neural differentiation of murine embryonic stem cells (murine ES cells) already exist (Okabe et al., 1996; Brüstle et al., 1999). In these strategies, differentiation is induced by aggregation of ES cells to embryoid bodies (EBs). The first part of this project focused on the question whether such a protocol for neural differentiation could be established for human ES cells too. Indeed, modification of several key steps, such as differentiation periods, media formulations and specific coatings permitted to generate an EB-based protocol for human ES cells. This new strategy led to the generation of highly enriched neural precursor cells expressing nestin and the neural markers PSA-NCAM and A2B5. After growth factor withdrawal, the generated neural precursors differentiated into neurons and glia cells, indicating their potential to generate cells of the neuronal and the glial lineage.<br /> In proof-of-principle experiments, it was investigated whether human ES cell-derived neural precursor cells have the potential to integrate into host tissue upon transplantation. For this aim, eGFP-expressing neural precursors were transplanted onto hippocampal slice cultures. Immunohistological analyses revealed that the transplanted cells were able to migrate into the slice and differentiate into neurons. To investigate whether the transplanted cells have the capacity to functionally mature within the host tissue, the cells were analyzed electrophysiologically at the Department of Epileptology (University of Bonn Medical Center). The experiments revealed that only a minority of cells were able to induce action potentials after 3 weeks of engraftment in hippocampal slices.<br /> In an additional set of experiments, the differentiation and migration properties of human ES cell-derived neural precursors upon in vivo transplantation were analyzed. For this purpose, precursor cells were transplanted into the developing brain of pre- and postnatal rats. In both cases, the cells formed clusters, from where single cells migrated Abstract 93 into the host tissues. The transplanted cells differentiated into neurons, as confirmed by the expression of neuron-specific markers.<br /> So far, protocols for the neural differentiation mostly depend on EB-formation, coculture with stromal cells, lineage-selection strategies or mechanical isolation of neural rosettelike structures from differentiated human ES cell cultures. For that reason, the second part of this thesis addresses the question, whether such intermediate steps could be avoided and human ES cells could be directly converted into neurogenic precursors. The newly established direct conversion paradigm consists of an adherent cultivation step, followed by cultivation as neurospheres. In the first step, human ES cells propagated as adherent cultures on extracellular matrix proteins were induced to differentiate into the neural lineage in differentiation media containing fibroblast growth factor-2 (FGF-2). In the second step, the adherent cells were proliferated to form detaching neurospheres. Upon plating, these neurospheres gave rise to a homogenous population of neural precursors capable of generating neurons, astrocytes and oligodendrocytes. In addition to the practical advantage, also a mechanistic knowledge could be gained with the adherently converted human ES cells: The findings suggest that FGF-2 exposure alone suffices to promote neural conversion of adherently growing human ES cell cultures. The results of this study should provide a basis for the efficient generation of neural cell types for analytic and biomedical applications.

<i><strong>In vitro</strong></i><strong> Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in Vorläufer des Zentralen Nervensystems</strong><br /> Humane embryonale Stammzellen (humane ES Zellen) sind durch ihre Eigenschaft der Pluripotenz und der uneingeschr änkten Vermehrbarkeit viel versprechende Kandidaten sowohl für die Grundlagenforschung als auch für zukünftige Transplantationsstrategien. Nachdem im Rahmen dieser Dissertation grundlegende Techniken zur Kultivierung humaner ES Zellen etabliert wurden, konnten 2 verschiedene Verfahren entwickelt werden, die zum Ziel hatten, neurale Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen (humane ES Zellen) zu gewinnen.<br /> Es existieren bereits neurale Differenzierungsstrategien für murine embryonale Stammzellen (murine ES Zellen), bei denen die Differenzierung der ES Zellen in Embryoidkörperchen, den so genannten Embryoid bodies (EB) induziert wird. In einem ersten Projektteil dieser Dissertation wurde daher untersucht, ob ein solches Verfahren auch für humane embryonale Stammzellen etabliert werden kann. Tatsächlich machte die Modifikation entscheidender Schritte, wie der Differenzierungszeiträume, Medienzusammensetzungen und spezifischer Beschichtungen möglich, ein EB-basiertes Protokoll für humane ES Zellen zu etablieren. <br /> Das auf diese Weise optimierte Verfahren führte zu einer hoch aufgereinigten Population neuraler Vorläuferzellen aus humanen ES Zellen, die Nestin und die neuralen Marker PSA-NCAM und A2B5 exprimieren. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit, nach Wachstumsfaktorentzug in Neurone und Gliazellen auszudifferenzieren. In Pilot-Experimenten wurde anschließend untersucht, ob die humanen ES Zellabgeleiteten neuralen Vorläuferzellen die Fähigkeit besitzen, nach Transplantation in das Empfängergewebe zu integrieren. Zu diesem Zweck wurden eGFP-exprimierende neurale Vorläufer auf hippocampale Schnittkulturen transplantiert. Immunhistologische Untersuchungen ergaben, dass die neuralen Vorläufer in das Gewebe migrierten und Marker reifer Neurone exprimierten. Um zu analysieren, ob sich die Zellen auch funktionell integrierten, wurden die Schnittkulturen am Institut für Epileptologie (Unikliniken Bonn) elektrophysiologisch untersucht. Es zeigte sich während der begrenzten Kultivierungsdauer von 3 Wochen auf den Schnittkulturen, dass nur eine Minderheit der Zellen die Fähigkeit besaß, Aktionspotentiale zu induzieren. <br /> Zusätzlich wurde untersucht, wie sich die humanen ES Zell-abgeleiteten Vorläufer nach in vivo Transplantation verhalten. Hierfür wurden die Zellen prä- und postnatal in das sich entwickelnde Gehirn der Ratte transplantiert. Die neuralen Vorläufer integrierten und migrierten in beiden Fällen in das Empfängergewebe, differenzierten in Neurone aus und exprimierten Neuron-spezifische Marker.<br /> Die meisten Protokolle zur neuralen Differenzierung humaner ES Zellen beruhen bislang auf EB-Bildung, Kokultur mit Stroma-Zellen, Lineage-selection-Strategien oder der mechanischen Isolierung neuraler Strukturen aus differenzierten humanen ES Zell- Kulturen.<br /> Aus diesem Grund sollte in dem zweiten Teil der Arbeit die Frage beantwortet werden, ob solche Zwischenschritte vermieden und humane ES Zellen direkt in neurale Vorläufer differenziert werden können. <br /> Dieses neue Differenzierungsprotokoll besteht aus einer adhärenten Konversion und der Kultivierung als Neurosphären. Im ersten Schritt werden humane ES Zellen zunächst adhärent auf extrazellulären Matrixproteinen in FGF-2-haltigem Differenzierungsmedium kultiviert und so die neurale Differenzierung induziert. Anschließend werden die entstanden Kolonien als Neurosphären kultiviert. Nachdem diese plattiert sind, entsteht eine hoch aufgereinigte Population neuraler Vorläuferzellen, die das Potential besitzen, in Neurone, Astrocyten und Oligodendrocyten zu differenzieren. <br /> Zusätzlich zu dem praktischen Vorteil, den dieses Protokoll liefert, können daraus auch mechanistische Erkenntnisse gewonnen werden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von FGF-2 ausreicht, um humane ES Zellen unter adhärenten Bedingungen neural zu konvertieren. Aus diesem Grund stellt dieses Protokoll eine Basis dar, um effizient neurale Zelltypen für analytische und biomedizinische Applikationen zu erzeugen.