Aufreinigung und Charakterisierung des D1-Proteins aus dem Photosystem II höherer Pflanzen

Abstract

Rückstände von Pflanzenschutzmitteln (Pestizide), insbesondere von Herbiziden, stellen eine immer weiter zunehmende Gefährdung für den Menschen und die Ökosysteme dar. Zum Schutz der menschlichen Gesundheit und der Umwelt hat der Gesetzgeber daher sehr niedrige Grenzwerte für Pestizide im Trinkwasser festgelegt.<br /> Über moderne chemische Analyseverfahren können die entsprechenden Xenobiotika, etwa Herbizide, innerhalb dieser Grenzwerte nachgewiesen werden. Zum Teil ist jedoch für die einzelnen Analysen ein hoher experimenteller Aufwand notwendig. Ein anderes Problem besteht darin, dass die entsprechenden Abbauprodukte der Herbizide und andere, noch unbekannte phytotoxische Substanzen, die eventuell noch stärker toxisch wirken können, bei derartigen Messungen nicht vollständig erfasst werden. Seit vielen Jahren wird deshalb an der Entwicklung von Biosensoren gearbeitet, die für eine alternative Detektion von Herbizidrückständen, auf der Basis ihrer phytotoxischen Wirkung auf das pflanzliche Photosystem II (PS II), geeignet sind. Durch den Einsatz eines Biosensors, basierend auf der biologischen Einheit des D1-Proteins, könnten diese Stoffe aufgrund ihrer ökotoxikologischen Wirkung auf die biologische Einheit als Summenparameter erfasst werden. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der vorliegenden Arbeit, Untersuchungen zum Einsatz des D1-Proteins als biologische Einheit für den biosensorischen Nachweis von PS-II-Herbiziden durchzuführen. Dazu wurde ein Biosensor, basierend auf einem funktionell intakten Herbizid-bindefähigen D1-Protein aus dem Photosystem II höherer Pflanzen, zum Nachweis von Photosystem-II-inhibierenden Substanzen entwickelt. <br /> Für einen in Zukunft möglichen Einsatz des Biosensors als Überwachungssystem zum direkten Nachweis von PS-II-Inhibitoren in Wasserproben war es wichtig, eine Biosensortechnik zu entwickeln, die ohne eine Markierung der zu untersuchenden Analyten auskommt. Daher wurde die optische Methode der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) verwendet, die sehr sensitive Messungen in Echtzeit ermöglicht. <br /> Für die Aufreinigung des D1-Proteins zum Einsatz als Zielstruktur im SPR-Biosensor sollte eine Isolationsmethode erarbeitet werden, die ein D1-Protein mit funktionell aktiver Q_B-Bindenische in hohen Ausbeuten, schnell und mit einem guten Aufreinigungsgrad liefert. Zur Isolation des D1-Proteins wurden daher verschiedene Methoden parallel untersucht und in ihrer Leistung miteinander verglichen.<br /> Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Aufreinigungsmethode entwickelt, über die es möglich ist, funktionell aktives D1-Protein mit einer bindefähigen Q_B-Bindenische für PS-II-Inhibitoren zu isolieren. Die Methode zur Isolierung und Aufreinigung des Membranproteins besteht im Wesentlichen aus folgenden Schritten: a) Thylakoidmembranisolation, b) Butanolextraktion von PS-II-Proteinkomplexen aus den Thylakoidmembranen und c) abschließende chromatographische Aufreinigung des D1-Proteins aus dem PS-II-Proteinkomplex über Reversed phase Fast protein liquid chromatography (RP-FPLC). <br /> Der Nachweis des D1-Proteins in den einzelnen Aufreinigungsstufen konnte mit den klassischen Methoden der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und dem Western-Blotting erbracht werden. <br /> Zusätzlich wurde eine ergänzende Methode zur biosensorischen Kontrolle der Aufreinigungsprozedur entwickelt und angewendet. Diese gestattet mit der Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Methodik über einen spezifischen Anti-D1-Antikörper einen einfachen und schnellen Nachweis des D1-Proteins in isolierten Fraktionen. <br /> Zur qualitativen Kontrolle der Bindefähigkeit des aufgereinigten D1-Proteins zu Herbiziden wurde eine SPR-Methode, basierend auf einem Simazinderivat (6-{[4-Chloro-6-(ethylamino)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-hexansäure) als Bindepartner, entwickelt, über die das aufgereinigte D1-Protein untersucht wurde. Besonders hervorzuheben ist, dass in dieser Arbeit die Eignung verschiedener Pflanzenspezies der höheren Pflanzen (<i>Vicia faba</i>, <i>Pisum sativum</i> und <i>Lactuca sativa</i>) als Ausgangsmaterial für die Isolation eines Herbizid-bindefähigen D1-Proteins in hohen Ausbeuten vergleichend charakterisiert wurde; das geschah anhand der klassischen Nachweismethoden sowie der Bindefähigkeit zu dem Simazinderivat. <br /> In den Untersuchungen dieser Arbeit konnte über diese verschiedenen Methoden zur Charakterisierung nicht nur gezeigt werden, dass das D1-Protein über die hier entwickelte Aufreinigungsmethode aus allen drei Pflanzenspezies isoliert werden kann, sondern auch, dass es sich noch in einem funktionell bindefähigen Zustand befindet. Anhand der entwickelten SPR-Methode, basierend auf einem Simazinderivat-Liganden, konnte die funktionelle Bindefähigkeit des aufgereinigten D1-Proteins aus allen drei Pflanzenspezies bestätigt werden. Beim Vergleich der untersuchten Pflanzenspezies kristallisierte sich <i>Vicia faba</i> als die zur Isolation von D1-Protein am besten geeignete Spezies heraus. Ferner war bemerkenswert, dass nur bei <i>Vicia faba</i> D1/D2-Dimere in den Isolaten der verschiedenen Aufreinigungsschritte gefunden wurden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde das D1-Protein von <i>Vicia faba</i> für die weitere Verwendung als biologische Einheit im SPR-Biosensor ausgewählt. <br /> Im Mittelpunkt des zweiten Teils der Arbeit stand der Einsatz des isolierten D1-Proteins für den biosensorischen Nachweis von PS-II-Herbiziden. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten D1-Protein-SPR-Biosensor konnte der direkte Nachweis der Herbizide Diuron, Atrazin und Metribuzin, bei einer Nachweisgrenze von 20 µg/ml für Diuron, 40 µg/ml für Atrazin und 80 µg/ml für Metribuzin, erbracht werden. Da diese Werte weit oberhalb der von den Trinkwasserverordnungen festgelegten Maximalmenge an Pestiziden im Trinkwasser liegen, sind für eine Anwendung des Biosensors im Rahmen des Nachweises von Herbiziden im Trinkwasser in Zukunft noch Optimierungen notwendig, um die Sensitivität des Biosensors zu erhöhen. <br /> Der hier entwickelte Biosensor kann die Gesamtheit aller in einer Probe enthaltenen PS-II-Inhibitoren aufgrund ihrer Wirkungsweise auf das D1-Protein als Summenparameter erfassen. In weiteren Entwicklungen scheint es möglich, diesen wirkungsbezogenen Nachweis der PS-II-Inhibitoren mit sensitiven chemischen Analysemethoden zu koppeln, um so die detektierten Schadstoffe direkt identifizieren zu können. <br /> Als Vorarbeit dazu wurde in dieser Arbeit ein pflanzliches SPR-Massenspektrometrie-System, bestehend aus einem Anti-Peroxidase-Antikörper und pflanzlicher Peroxidase, als Testsystem entwickelt. Mit diesem System wurde gezeigt, dass der biosensorische Nachweis eines Analyten über sein Wirkpotential auf die biologische Zielstruktur mit der genauen Bestimmung der Substanz über massenspektrometrische Analysen reproduzierbar gekoppelt werden kann. <br /> Damit konnte für die zukünftige Entwicklung eines Biosensors zum qualitativen und quantitativen Nachweis von PS-II-Inhibitoren eine Möglichkeit zur Verbindung des über die SPR-Biosensorik geführten wirkungsbezogenen Nachweises von PS-II-Inhibitoren (z. B. von Herbiziden) mit der klassischen Analytik der Massenspektrometrie aufgezeigt werden.