Gaschromatographisch/massenspektrometrische Quantifizierung von oral verabreichten deuterierten Sterolen im Serum als Indikatoren für die intestinale Sterolresorption im Rahmen einer klinischen Studie zur Wirkung von Ezetimib und Simvastatin

Abstract

<u>Einführung:</u> Zur Bestimmung der intestinalen Resorption von Sterolen in klinischen Studien wird die <i>continuous feeding dual stable isotope method</i> verwendet. Dazu nehmen die Studienteilnehmer mit Deuterium (D) markierte Sterole oral zu sich und danach wird der Anteil der nicht-resorbierten markierten Sterole in den Faeces bestimmt. Das regelmäßige Sammeln der Faecesproben erfordert eine gute Compliance der Studienteilnehmer. Eine Quantifizierung der resorbierten deuterierten Sterole im Serum wurde bisher aufgrund ihrer sehr niedrigen Konzentrationen im Serum nicht durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine gaschromatographisch/massenspektrometrische (GC/MS) Methode zur Quantifizierung von deuteriertem und natürlichem Cholesterol, Campesterol und Sitosterol im Serum aufzubauen, um anschließend den Zusammenhang zwischen den Serumkonzentrationen der Sterole und der Cholesterolresorption zu untersuchen. <br /><u>Methoden:</u> Von 37 männlichen Patienten mit Hypercholesterolämie wurden insgesamt 148 Blutproben untersucht. Die Patienten nahmen an einer Cross-Over-Studie zur Wirkung von Placebo, Simvastatin, Ezetimib und der Kombination von Simvastatin plus Ezetimib auf die Cholesterolresorption und -synthese teil. In der jeweils letzten Woche der vier jeweils siebenwöchigen Behandlungsphasen nahmen die Studienteilnehmer dreimal täglich eine Kapsel mit D₆-Cholesterol, D₆-Campesterol, D₆-Sitosterol sowie D₄-Sitostanol als nicht resorbierbaren Marker oral zu sich. An den letzten vier Tagen der Kapseleinnahme wurden Stuhlproben für die Bestimmung der Sterolresorption gesammelt. Die Serumproben wurden jeweils am Ende jeder Behandlungsphase gewonnen und mit den Faecesproben bis zur Analyse bei -20°C gelagert.<br /><u>Ergebnisse:</u> Um die deuterierten Sterole simultan mit den entsprechend natürlich vorkommenden Sterolen in den Serumproben zu quantifizieren, wurden, basierend auf einer etablierten Methode, zuverlässige GC/MS-Methoden mit hohem Nachweisvermögen erfolgreich aufgebaut, validiert und angewendet. Die absoluten und insbesondere cholesterol-standardisierten Serumkonzentrationen von D₆-Cholesterol, D₆-Campesterol, D₆-Sitosterol korrelierten unter der Behandlung mit Placebo signifikant positiv mit der Cholesterolresorption (<i>r</i> zwischen 0,578 und 0,731; <i>P</i> < 0,001 und n = 33 für alle). Die cholesterol-standardisierte Serumkonzentration von D₆-Cholesterol war unter Simvastatin im Mittel um 7,5 % erhöht gegenüber Placebo (<i>P</i> = 0,037) und unter Ezetimib und Simvastatin plus Ezetimib signifikant erniedrigt (-52 % bzw. -47 %, <i>P</i> < 0,001 für beide vs. Placebo; <i>P</i> = 0,114 Ezetimib vs. Simvastatin plus Ezetimib). Die mittleren Änderungen des Serumquotienten reflektierten die Änderungen der Cholesterolresorption in den Behandlungsphasen (Simvastatin: +7 %, <i>P</i> = 0,051; Ezetimib: -57 %, <i>P</i> < 0,001; Simvastatin plus Ezetimib: -52 %, <i>P</i> < 0,001 vs. Placebo, <i>P</i> = 0,186 vs. Ezetimib).<br /><u>Schlussfolgerung:</u> Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die cholesterol-standardisierten Serumkonzentrationen von oral verabreichtem D₆-Cholesterol, D₆-Campesterol, D₆-Sitosterol Indikatoren für die Effizienz der Sterolresorption bei Hypercholesterolämiepatienten darstellen und dass insbesondere die Quantifizierung von D₆-Cholesterol im Verhältnis zu Cholesterol im Serum mittels GC/MS als vereinfachtes Verfahren anstelle der <i>continuous feeding dual stable isotope method</i> verwendet werden kann, um Änderungen der Cholesterolresorption zu untersuchen.

<strong>Gaschromatographic/mass spectrometric quantification of orally administered deuterated sterols in serum as indicators of intestinal sterol absorption</strong><br /><u>Introduction:</u> The <i>continuous feeding dual stable isotope method</i> is applied for the determination of intestinal absorption of sterols in clinical trials. For this purpose deuterium-labeled (d) sterols are administered orally and afterwards the proportion of non-absorbed labeled sterols is determined in feces of the study participants. The regular collection of fecal samples requires a good compliance of the study participants. Quantification of absorbed deuterated sterols in serum has not been performed yet due to their very low concentrations in serum. The objective of the present work was to establish a gaschromatographic/mass spectrometric (GC/MS) method for quantification of deuterated and natural cholesterol, campesterol and sitosterol in serum in order to examine the relation between serum concentrations of sterols and cholesterol absorption. <br /><u>Methods:</u> 148 blood samples of 37 male patients with hypercholesterolemia were assayed. The patients took part in a cross-over study on the effects of placebo, simvastatin, ezetimibe and a combination of simvastatin and ezetimibe on cholesterol absorption and synthesis. In the last week of each of the four seven-week-treatment periods study participants swallowed a capsule three times daily containing the deuterated sterols d₆-cholesterol, d₆-campesterol, d₆-sitosterol together with d₄-sitostanol as non-absorbable marker. Fecal samples were collected on the last four days of capsule intake for determination of sterol absorption. Serum samples were attained at the end of each treatment period and were stored frozen together with the fecal samples at -20°C until analysis.<br /><u>Results:</u> For the simultaneous determination of the labeled and corresponding non-labeled sterols in serum samples reliable GC/MS-methods with high sensitivity were established, validated, and successfully applied. The absolute and particularly the cholesterol-standardized concentrations of d₆-cholesterol, d₆-campesterol, d₆-sitosterol in serum exhibited a significantly positive correlation with cholesterol absorption under placebo treatment (<i>r</i> between 0,578 and 0,731; <i>P</i> < 0,001 and n = 33 for all). D₆-cholesterol (expressed as ratio to cholesterol) in serum was increased by 7,5 % on average under treatment with simvastatin compared to placebo (<i>P</i> = 0,037) and significantly decreased by ezetimibe monotherapy and combination treatment with ezetimibe plus simvastatin (-52 % and -47 %, respectively; <i>P</i> < 0,001 for both vs. placebo; <i>P</i> = 0,114 for ezetimibe vs. simvastatin plus ezetimibe). The mean changes of the ratio d₆-cholesterol/cholesterol in serum reflected the changes of cholesterol absorption during the treatment periods (simvastatin: +7 %, <i>P</i> = 0,051; ezetimibe: -57 %, <i>P</i> < 0,001; simvastatin plus ezetimibe: -52 %; <i>P</i> < 0,001 vs. placebo, <i>P</i> = 0,186 vs. ezetimibe).<br /><u>Conclusion:</u> The results suggest that cholesterol-standardized concentrations of orally administered d₆-cholesterol, d₆-campesterol, d₆-sitosterol in serum are indicators of cholesterol absorption efficiency in patients with hypercholesterolemia and that quantification of particularly d₆-cholesterol as ratio to cholesterol in serum by GC/MS can be used as an easier approach to replace the <i>continuous feeding dual stable isotope method</i> for examining changes in cholesterol absorption.