Aptamerselektion zur Funktionsuntersuchung von zytosolischen Proteinen

Abstract

Zur biologischen Einordnung der CC-bindenden Proteine CYTIP und KIAA0403 einem auf Genomebene neu entdeckten Vertreter, wie auch FHL2, einem vielseitigen Ko-Transkriptionsfaktor, wurde die Aptamertechnologie zur in vitro Selektion von einzel-strängigen inhibitorisch wirksamen RNA-Biopolymeren angewandt.<br /> In der vorliegenden Arbeit werden mehrere Ansätze der in vitro Selektion aus unterschiedlich langen kombinatorischen RNA-Bibliotheken beschrieben, welche bei KIAA0403 (K21 Aptamer) und FHL2 (K12 und K16 Aptamere) zu zwei erfolgreichen Anreicherungen von RNA-bindenden Spezies führten. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Aptamer-selektion gegen das Protein CYTIP aufgrund targetspezifischer Gegebenheiten unter den angewandten Bedingungen nicht durchgeführt werden konnte. Es wird das erste Beispiel eines Aptamers (K21) beschrieben, dass aus einer unabhängigen Selektion gegen das verkürzte KIAA0403-ΔN291 evolviert wurde. Dieses verfügt dennoch ähnliche Bindungscharakteristika wie das zuvor von Theis et al.[57] selektierte K61 Aptamer, das aus einer Cytohesin 2 Selektion hervorgegangen ist. <br /> Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass KIAA0403, ein bis dahin nur theoretisch beschriebenes Protein unbekannter Funktion, ein neues Mitglied der CC-Binder ist und im nanomolaren Bereich eine ausgeprägte Wechselwirkung mit den getesteten Mitgliedern der Cytohesin Familie eingeht. Weiterführende Studien konnten belegen, dass K61 ebenfalls eine targetspezifische Erkennung beider natürlich vorkommenden Partner besitzt. <br /> Letztendlich konnte die spezifische Bindung des K21 Aptamers auf eine für die Interaktion essentielle Konsensussequenz von sechs Nukleotiden zurückgeführt werden, welche gemeinsam von beiden RNA-Spezies geteilt wird und wahrscheinlich für die Erkennung beider Proteine verantwortlich ist. Die Ergebnisse der Kompetitionsstudien weisen auf ein sehr stark überlappendes Bindungsepitop der Aptamere auf beiden Interaktionspartnern hin, so dass unter Berücksichtigung der Protein-Protein Affinität der C-terminalen 125 Aminosäuren von KIAA0403 und der Cytohesin 2 CC-Domäne der Rückschluss auf eine ähnliche dreidimensionale Faltstruktur dieser Proteinregionen gezogen werden kann. Durch Überexpressionsstudien in HeLa-Zellen konnte darüber hinaus ein erster Hinweis auf die biologische Relevanz von KIAA0403 erlangt werden.