Die Biogenese der Haut

Abstract

Die Epidermis ist ein sehr komplexes Organ. Es besteht aus Zellen die sich in unterschiedlichen Phasen ihres Zyklus befinden. Die Zellen in der untersten Schicht der Haut (Basalschicht) befinden sich im Prozess der Zellteilung, sie proliferieren; oder sie differenzieren, durchlaufen also die verschiedenen Phasen der terminalen Differenzierung. Dieser Prozess mündet in der Etablierung einer äußeren Schicht aus toten Keratinozyten umhüllt von einer dreidimensionalen Matrix aus Proteinen. An die Proteine sind Lipide, besonders Ceramide und Fettsäuren mit langkettigen hydrophoben Bereichen, kovalent gebunden. Diese Lipide bilden die Permeabilitätsbarriere, die eine fundamentale Rolle in der Wasser- Homeostasis spielt.<br /> Um die Bildung der Wasser- Permeabilitätsbarriere studieren zu können, haben wir in unserem Labor ein Zellkultur- Model entwickelt, welches es uns, je nach Kulturbedingungen, erlaubt, Keratinozyten in einem Zustand der Proliferation (0,1 mM Calcium Gehalt im Medium) oder der Differenzierung (1,1 mM Calcium Gehalt im Medium) zu halten. Diese Zellen differenzieren durch die verschiedenen Stadien, erreichen aber nie das letzte Stadium des stratum corneums. Dennoch sind sie in der Lage die meisten Ceramide, insbesondere die langkettigen, die für die Barriere benötigt werden, zu synthetisieren. Wir haben die verschiedenen Kulturbedingungen charakterisiert, in denen die Keratinozyten kultiviert wurden. Wir haben das mRNA Expressionsprofil von Keratinozyten in low Calcium (0,1 mM Calcium) und high Calcium Medium (1,1 mM Calcium) erstellt. Wir haben außerdem den Einfluss von Linolsäure und Vitamin C auf das Expressionsprofil untersucht. Dieses Profil umfasst das mRNA Expressionsmuster von Enzymen des Ceramid- Stoffwechsels (Saure Ceramidase, Saure Sphingomyelinase, Serin- Palmitoyltransferase, Sap-C) sowie von Proteinen, die an der Permeabilitätsbarriere beteiligt sind (Profilaggrin). Wir untersuchten auch die mRNA Expression von Markern der Keratinozyten- Proliferation (Keratin 14) und -Differenzierung (Keratin 10). <br /> Der Calcium- Shift bewirkt eine Veränderung des Zellzyklus von Keratinocytes. Die mRNA Expression von Keratin 14 sinkt, wogegen die Expression von Keratin 10 auf das 75- fache steigt. Der Calcium- Shift resultiert auch in einer Erhöhung des mRNA Spiegels von Profilaggrin (55 Fach), Glucosylceramide Synthase (40 Fach), β-Glucocerebrosidase (30 Fach), Prosaposin (15 Fach), Saure Sphingomyelinase (5 Fach), und Serin Palmitoyltransferase (Untereinheit LC2, 4 Fach). Andererseits hat sich der mRNA Spiegel der Sauren Ceramidase nicht signifikant verändert. Die Zugabe von Linolsäure hat den Spiegel aller Marker erhöht. Dagegen hat die Zugabe von Vitamin C keine Veränderung der mRNA Spiegel bewirkt. Diese Veränderung der Expressionsprofile der verschiedenen Marker zeigt, dass der Calcium- Shift die Keratinozyten dazu bringt, das proliferierende Stadium des stratum basale zu verlassen, und stattdessen zu differenzieren. Dabei durchlaufen die Zellen die verschiedenen Stadien der Differenzierung, vom stratum granulosum bis, im Prinzip, zum stratum corneum. Wie bereits erwähnt können die Zellen dieses Stadium jedoch nicht erreichen.<br /> Nach dem wir diese Expressionsprofile etabliert hatten, untersuchten wir den Effekt von Stickstoff Monoxid (NO) auf die Differenzierung von Keratinozyten. Dazu haben wir einen NO Donor (S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine, SNAP 0,2 mM) oder eine NO Synthase Prodrug Inhibitor (N^G-nitro-L-arginine-methyl ester, L-NAME, 10 mM) zum Kulturmedium der Keratinozyten dazugegeben.<br /> Frühere Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass die Zugabe von SNAP in Konzentrationen von weniger als 0,25 mM die Proliferation der Keratinozyten stimuliert. In dieser Arbeit hatte der Zusatz von SNAP zum Kulturmedium die Morphologie der Keratinozyten nicht verändert. Andererseits hatte SNAP einen apoptotischen Effekt auf Fibroblasten. Die Analyse der mRNA Expressionsprofile von mit SNAP behandelten Keratinozyten hat gezeigt, dass die Zellen trotz Calcium- Shift in einem proliferativen Zustand verbleiben. Sie zeigen einen 3 Fachen Anstieg der mRNA Expression von Keratin 14, einem Basal- Marker, und eine deutlichen Reduzierung des mRNA Spiegels von Keratin 10 (Differenzierungsmarker). Der NO Synthase Inhibitor L-NAME bewirkte nach 24 Stunden in Keratinozyten eine vorübergehende Erhöhung des Ceramid- Spiegels, gefolgt von Apoptose. Dies war in Fibroblasten nicht der Fall. Sowohl SNAP als auch L-NAME reduzierten den mRNA Spiegel der meisten Proteine des Ceramid- Stoffwechsels auf ein vernachlässigbares Niveau. Eine weitere Analyse mit radioaktivem Serin zeigte, dass der beobachtete Ceramid- Peak nach 24 Stunden vornehmlich vom Abbau von Sphingomyelin, und nicht von de novo Ceramid- Biosynthese stammte. <br /> Ceramide sind wichtige Komponenten der Wasser- und Elektrolytenbarriere der Haut von Säugetieren. Diese Ceramide enthalten sehr langkettige, ω-hydroxylierte Fettsäuren. Diese können darüber hinaus mit Linolsäure verestert werden. Glucosylceramid ist die Transport- Form für diese besonderen Ceramide. Um die Rolle von Glucosylceramid in der Barriere- Funktion der Epidermis zu studieren, haben wir, zusammen mit der Gruppe von Prof. Gröne im DKFZ in Heidelberg, eine hautspezifische konstitutive Glucosylceramid- Synthase defiziente Maus generiert. Die Haut dieser Mäuse zeigte 4 Tage nach der Geburt Hautabschuppung und einen sehr starken transepidermalen Wasserverlust. Außerdem zeigte die Haut schwere strukturelle Defekte wie eine stark angeschwollene Epidermis mit hyperproliferativen Keratinozyten, erhöhte Apoptose, abgelöstes stratum corneum, sowie eine ungewöhnliche Verteilung der epidermalen Keratine. Die Lamellar- bodies des stratum granulosum weisen eine unregelmäßige Anordnung auf, und die Korneozyten des stratum corneum waren dicht zusammengedrängt. Alle Mäuse starben 5 Tage nach der Geburt. Die Deletion des Glucosylceramid- Synthase- Gens führte also zur Veränderung und schließlich zum Versagen der Barriere- Funktion der Haut. Wir haben außerdem festgestellt, dass Keratinozyten möglicherweise über einen Kompensationsmechanismus verfügen, um den Verlust von Glucosylceramide auszugleichen. Keratinozyten scheinen in der Lage zu sein, langkettiges Sphingomyelin mit ω-veresterten Fettsäuren zu bilden. Dieser Kompensationsmechanismus ist aber entweder zu langsam, oder nicht an die Funktion der Wasserbarriere angepasst. Es ist möglich, dass die Phosphocholin-Kopfgruppe des Sphingomyelins störend auf den sehr strukturierten Assemblierungsprozess der Permeabilitätsbarriere wirkt.