Charakterisierung einer konditional Connexin36-defizienten Mausmutante sowie Vorversuche zur funktionellen Analyse von Horizontalzellen in der Retina

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mausmutante, die <em>Cx36flox(CFP)</em>-Maus, erzeugt, in der das Connexin36 (Cx36)-Protein konditional durch das blaue Fluoreszenz-Protein (<em>cyan fluorescent protein</em>, CFP) ersetzt werden konnte. Es wurde gezeigt, dass diese Maus alle gewünschten Eigenschaften einer konditionalen Cx36-defizienten Mutante aufweist: Das Cx36-Protein wird in Anwesenheit der loxP-Erkennungssequenzen ausgeprägt und bildet funktionelle Gap Junction-Kanäle. Wenn die gefloxte Cx36-kodierende Region durch die Phosphoglyzeratkinase- oder die Nestin-Cre-Rekombinase deletiert wird, wird das CFP-Reportergen exprimiert. Dabei ist die CFP-Expression generell ein verlässlicher Reporter für die Cx36-Ausprägung. Experimente mit Cre-Rekombinasen, ausgeprägt unter der Kontrolle weiterer Promotoren, deuten darauf hin, dass eine Deletion von Cx36 nicht mit allen Cre-Transgenen erzielt werden kann, wie es in der <em>Cx36flox(LacZ)</em>-Maus der Fall ist. Es scheint, dass die loxP-Stellen der <em>Cx36flox(CFP)</em>-Mutante vermutlich nach der Geburt nicht mehr zugänglich für die Cre-Rekombinase sind. Um mit der konditional Cx36-defizienten Maus zu arbeiten, ist daher eine sorgfältige Analyse zur Identifikation der Zellen erforderlich, in denen Cx36 durch eine bestimmte Cre-Rekombinase deletiert wurde. Durch Verpaarung von <em>Cx36flox(CFP)</em>-Mäusen mit Parvalbumin-Cre-transgenen Mäusen wurde eine Deletion von Cx36 in den Kleinhirnkernen, nicht aber in den Neuronen der inferioren Olive erzielt. Es wurde in einem Verhaltenstest gezeigt, dass diese Mäuse im Gegensatz zu ubiquitär Cx36-deletierten Mäusen keine vom Lernen abhängige zeitliche Koordination des Augenblink- Reflexes aufweisen. Durch die gezielte Ausschaltung von Cx36 in neuronalen Subtypen konnte so die Rolle der elektrotonischen Kopplung in einem bestimmten Bereich des Zentralen Nervensystems, der inferioren Olive, analysiert werden. <br /> Des Weiteren wurden in dieser Arbeit Antikörper gegen das Connexin57 (Cx57)-Protein charakterisiert. Anhand von Cx57-Defekt-Mäusen wurde gezeigt, dass die <em>Cx57-Mid</em>-Antikörper Cx57 spezifisch in Horizontalzellen der Retina erkennen. Damit wurde zum ersten Mal der Nachweis erbracht, dass Cx57 als Protein in diesem Zelltyp vorliegt. <br /> Der in dieser Arbeit klonierte <em>pKW-DTRfrtCre</em>-Austauschvektor erlaubt die Herstellung einer transgenen Mausmutante, in der die Horizontalzellen selektiv und mithilfe des Diphtherietoxin-Rezeptor (DTR)/Diphtherie(DT)-Systems induziert ablatiert werden können. Die Verpaarung dieser Mäuse mit transgenen, ubiquitär deletierenden Flp-Rekombinase-Mäusen ermöglicht die Horizontalzell-spezifische Deletion von gefloxten Genen. Darauf deuten Zellkulturversuche hin, in denen das <em>DTRfrtCre</em>-Konstrukt vor und nach Deletion durch die Flp-Rekombinase getestet wurde. Mit diesen „genetischen Werkzeugen“ und den Cx57-spezifischen Antikörpern kann die Biologie der Horizontalzellen weiter erforschet werden.