Untersuchung der Expression und Funktion des Tac2 Gens in der Maus

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von NKB im ZNS und in peripheren Geweben der Maus durch in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und RT-PCR zu untersuchen. <br /> Tac2 mRNA und Immunoreaktivität für das NKB Vorläuferprotein pep2 konnte in vielen Bereichen des Gehirns nachgewiesen werden. Eine starke Expression wurde vor allem in Bereichen des Thalamus und Hypothalamus (Habenulae, Nucleus anterior dorsalis, Area preoptica, Nucleus arcuatus) beobachtet. Beim Vergleich des murinen Expressionsmusters mit dem der Ratte konnten einige Abweichungen festgestellt werden. Nur bei Ratten konnte eine Expression von Tac2 mRNA im Nucleus des lateralen olfactorischen Traktes und im Hippocampus nachgewiesen werden. Entsprechend fehlten bei Mäusen auch Signale für NKB in den Projektionsgebieten, wohingegen bei Ratten die Signale vorhanden waren. NKB zeigt die höchste Affinität zum NK3 Rezeptor. Daher wurde auch das Expressionsmuster für NK3 mRNA untersucht. Obwohl für Tac2 mRNA Abweichungen zwischen Maus und Ratte beobachtet worden waren, traf dies nicht auf die Expressionsmuster für NK3 zu. Die Signale für NK3 mRNA ergaben wider Erwarten in Gehirnen von Mäusen und Ratten identische Muster. Es gab allerdings Abweichungen zwischen der pep2-IR und dem NK3 Expressionsmuster im Hippocampus und in der Amygdala, was teilweise damit erklärt werden kann, dass andere Tachykinine in diesen Regionen NK3 Rezeptoren aktivieren könnten.<br /> Die Untersuchung der peripheren Gewebe ergab, dass Tac2 mRNA ausserhalb des Gehirns noch in weiteren Geweben (Rückenmark, Auge, Dick- und Dünndarm, Milz, Nebenniere Thymus, Uterus, Plazenta) nachgewiesen werden konnte. Die NK3 Expression konnte nur in wenigen peripheren Geweben (Magen, Dick- und Dünndarm, Ovar) und im Rückenmark und im Auge nachgeweisen werden. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Expressionsstudien für den Menschen konnte keine Tac2 mRNA in der Niere, der Lunge oder der Leber von Mäusen nachgewiesen werden.<br /> Um die Funktion des murinen Tac2 Gens zu untersuchen, sollte eine gezielte Deletion dieses Gens durchgeführt werden. Dazu wurde ein Targeting-Vektor hergestellt und in ES-Zellen elektroporiert. Mit Hilfe von Markern (Neomycinresistenz, Abwesenheit des Gens für HSV-TK) und der Southern Blot Methode wurden diese Zellen selektiert und auf homologe Rekombination überprüft. Insgesamt wurden vier Klone ausgewählt, die in Blastozysten injiziert oder mit Morulae aggregiert wurden. Nach dem Retransfer in scheinträchtige Weibchen wurden chimäre Tiere geboren, die eine Chimäritätsgrad zwischen 10% und 70% zeigten. Alle Tiere, die einen Chimäritätsgrad von mehr als 10% zeigten, wurden verpaart. Aus diesen Verpaarungen sind jedoch keine heterozygoten Tiere hervorgegangen, was darauf hinweist, dass die Deletion des Gens nicht in die Keimbahn der Tiere integriert werden konnte.