Molekulargenetische und Zellbiologische Untersuchungen zur Par-4-induzierten Apoptose

Abstract

Auf der Suche nach neuen Par-4 Interaktionspartnern, die möglicherweise an den bisher nur unvollständig aufgeklärten Mechanismen der Par-4/Dlk-vermittelten Apoptose beteiligt sind, wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid Systems der neue Par-4 Interaktionspartner Amida isoliert und eingehend charakterisiert. Die Interaktion beider Proteine konnte mittels GST-Pulldown- und Koimmunpräzipitationsversuchen verifiziert werden und der Leucin-Zipper von Par-4 sowie der C-Terminus des Amida Proteins wurden als Interaktionsdomänen identifiziert. Die Expression des Amida Proteins in Rattenfibroblasten zeigte eine hauptsächlich nukleäre Lokalisation und eine Akkumulation in PML-NBs. Amida war in Heterokaryons zu einer nukleo-zytoplasmatischen Translokation fähig und eine potentielle NES-Sequenz konnte im Ratten Amida Protein identifiziert werden. Die Koexpression von Par-4 und Amida in Rattenfibroblasten führte zu einer Relokalisation des kernständigen Amida an zytoplasmatische Aktinfilamente, einer Kolokalisation mit Par-4 und zu einer effizienten Apoptoseinduktion. Dabei erwies sich sowohl die Aktinbindung des Par-4 Proteins als auch die Komplexbildung von Amida und Par-4 als essentiell für die Rekrutierung des Amida Proteins an Aktinfilamente und die Apoptoseinduktion, ähnlich wie es auch schon für die Par-4/Dlk-vermittelte Apoptose gezeigt werden konnte. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse führen somit zu der Vermutung, dass es sich bei der Par-4-vermittelten Rekrutierung von pro-apoptotischen Effektormolekülen an das Aktin-Zytoskelett um einen neuen generellen Mechanismus der Par-4-induzierten Apoptose handelt.<br /> Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Par-4 Phosphorylierung für die Par-4/Dlk-vermittelte Apoptose näher untersucht. Es zeigte sich, dass das Par-4 Protein sowohl ein Substrat für die Dlk als auch für die PKA darstellt, das von der Dlk an Serin- und Threoninresten, von der PKA jedoch ausschließlich an Serinresten phosphoryliert wird. Zur Identifizierung der Dlk Phosphorylierungsstellen im Par-4 Protein wurden verschiedene Par-4 Phosphorylierungsmutanten hergestellt und in <i>in vitro</i> Phosphorylierungs- und Koexpressionsstudien untersucht und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Aminosäure T155 im Par-4 Protein bevorzugt von der Dlk phosphoryliert wird, und dass eine Phosphorylierung des Par-4 Proteins an der Aminosäure Threonin 155 essentiell ist für die Einleitung der Par-4/Dlk- und auch für die Par-4/Amida-vermittelte Apoptose. Die Phosphorylierung durch die Dlk sowie die Apoptoseinduktion treten dabei <i>in vivo</i> unabhängig von der PKA-Aktivität auf.