Herstellung von Austauschvektoren zur Erzeugung von Mäusen, die die Fusionsproteine Connexin45-CFP oder Connexin45-GFP ausprägen

Abstract

Für Untersuchungen der genauen Lokalisation des Cx45 Proteins in Geweben wurde ein Austauschvektor erstellt, bestehend aus zur Verfügung stehenden Sequenzabschnitten des Cx45 und dem „enhanced cyano fluorescent protein (eCFP)“. In diesem Vektor befinden sich Cx45 mit deletiertem Stop Codon und eCFP im gleichen Leseraster, so dass bei einer Expression ein Fusionsprotein aus Cx45 und eCFP entstehen kann. Der Vektor wurde in embryonale Stammzellen transfiziert und positive Klone wurden durch PCR, fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen und Southern Blot Hybridisierungs Analysen bestätigt. Diese ES Zellen können für die Erzeugung einer transgenen Maus verwendet werden.<br /> Außerdem wurde ein Shuttlevektor kloniert, mit dessen Hilfe ein BAC Vektor durch homologe Rekombination in E.coli Bakterien verändert werden konnte. Dieser BAC Vektor beinhaltet nach der homologen Rekombination die Sequenz von Connexin45 mit deletiertem Stop Codon und eGFP im selben Leseraster Die Expression eines Fusionsproteins steht dabei unter dem endogenen Cx45 Promotor. Dieser BAC Vektor kann für die Oozyten Injektion verwendet werden, um eine transgene Maus herzustellen, die das Fusionsprotein aus Cx45 und eGFP überexprimiert durch zufällige Insertion des Vektors in das Zielgenom. Außerdem wurde ein Vektor erzeugt, der in HeLa Zellen transfiziert wurde und dort zur Expression von blau fluoreszierenden membranständigen Gap Junction Plaques führte. Diese Plaques konnte mit Hilfe von Antikörper gegen Cx45, bestätigt werden. Es wurde ein positiver Klon aus diesen Versuchen gewonnen.<br /> Zur weitergehenden Untersuchung des neuronalen Cx36 wurde die Vorstufe eines Austauschvektors, unter Verwendung verschiedener Zwischenvektoren, erstellt. Dieser Austauschvektor wurde mittels kodierender DNAs von Maus Cx36 und eCFP kloniert. Die Sequenzen von Cx36 und eCFP befinden sich im Leseraster, das Stop Codon des Cx36 wurde deletiert, so dass bei der Expression im Zellkultursystem oder in der Maus ein Fusionsprodukt entstehen kann. Mit diesem Fusionsprotein aus Cx36 und eCFP kann die Lokalisation des Connexin36 in Geweben der Cx36 auch ohne Antikörper gegen Cx36 durchgeführt werden. Der Vektor eignet sich für Untersuchungen in HeLa Zellkultursystemen.