Aufbau eines pharma-/toxikologischen Testsystems für die Säuger-Kaliumkanäle mKir2.1 und hERG mit Hilfe des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae
Aufbau eines pharma-/toxikologischen Testsystems für die Säuger-Kaliumkanäle mKir2.1 und hERG mit Hilfe des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae
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DissertationPrüfungsdatum
15.06.2007Datum der Veröffentlichung
2007Erstgutachter
Lichtenberg-Fraté, HellaZweitgutachter
Höfer, MilanMetadaten
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Inhalt
Die humanen Kaliumkanäle hERG und Kir2.1 tragen wesentlich zur Repolarisierung des kardialen Membranpotentials bei (Sanguinetti et al., 1995; Wible et al., 1995). Fehlfunktionen in diesen Kanälen können zu einer Verzögerung der kardialen Repolarisation, einer Verlängerung des QT-Intervalls im Oberflächen-EKG und zu lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen führen (Tristani-Firouzi et al., 2002; Sanguinetti & Tristani-Firouzi, 2006).
Ziel der Arbeit war die Charakterisierung von hERG und dem zum humanen Kir2.1-Protein orthologen Kir2.1-Protein aus der Maus in Saccharomyces cerevisiae K+-Transportmutanten. Die funktionelle Expression von chromosomal als auch episomal exprimierter mKir2.1-cDNA komplementierte den mutanten Wachstumsphänotyp unter nicht permissiven Bedingungen (3-10 mM KCl) in Abhängigkeit vom externen pH. GFP-mKir2.1 Fusionsproteine konnten in der Plasmamembran oder zumindest in unmittelbarer Nähe zu dieser lokalisiert werden. Unter nicht permissiven (20 mM KCl) wie auch permissiven Bedingungen (100 mM KCl) zeigten mKir2.1 exprimierende Zellen, verglichen mit einem Kontrollstamm ohne mKir2.1, eine deutlich verringerte Sensitivität gegenüber dem als Indikator für das Membranpotential beschriebenen Antibiotikum Hygromycin B, was auf eine Membrandepolarisierung mit funktionellem mKir2.1 hindeutet. Die Untersuchung des Wachstums von mKir2.1 exprimierenden Stämmen bei Zugabe der bekannten Blocker von Kir2.1 Ag+, Cs+, Ba2+ und 48F10 zeigte unter K+-limitierenden Bedingungen eine signifikante Inhibierung von mKir2.1 spezifischem Wachstum. Im Zuge der Entwicklung eines standardisierten Testsystems zur Durchmusterung von potentiellen Modulatoren von Kir2.1 wurde in einem Ringtest die Übertragbarkeit dieser Wachstumstests auf andere Labore am Beispiel eines standardisierten CsCl-Test untersucht und bestätigt. Unter permissiven Bedingungen (≥ 50 mM KCl) und pH 7 führte darüber hinaus die Expression von mKir2.1 zu einer signifikanten Wachstumsinhibierung und damit zu einem weiteren mKir2.1 spezifischen Phänotyp. Diese Wachstumsinhibierung konnte durch Zugabe von CsCl und in K+-Effluxmutanten durch Zugabe von BaCl2 aufgehoben werden.
Damit konnte für diesen K+-Kanal die funktionelle heterologe Expression gezeigt werden und es wurden zwei neue, bisher nicht beschriebene Phänotypen identifiziert. Mit den konstruierten Hefestämmen steht ein pharma-/toxikologisches Testsystem zur Verfügung, für das die Sensitivität, Spezifität und der Vergleich mit dem ‚Gold Standard’ unter standardisierten Bedingungen gezeigt werden konnte.
Die Expression von HERG-cDNA führte in S. cerevisiae K+-Aufnahmemutanten zu keiner Komplementation des mutanten Wachstumsphänotyps. Bei der Expression von Fusionskonstrukten aus GFP und HERG konnte keine Lokalisation an der Zelloberfläche beobachtet werden. Auch die Konstruktion verschiedener HERG-Modifikationen im Sinne eines verbesserten Membran- ‚Targeting’ und/oder verbessertem ER-Exports konnten keine Lokalisierung in oder in der Nähe der Plasmamembran sowie keine erfolgreiche Komplementation bewirken.
Ziel der Arbeit war die Charakterisierung von hERG und dem zum humanen Kir2.1-Protein orthologen Kir2.1-Protein aus der Maus in Saccharomyces cerevisiae K+-Transportmutanten. Die funktionelle Expression von chromosomal als auch episomal exprimierter mKir2.1-cDNA komplementierte den mutanten Wachstumsphänotyp unter nicht permissiven Bedingungen (3-10 mM KCl) in Abhängigkeit vom externen pH. GFP-mKir2.1 Fusionsproteine konnten in der Plasmamembran oder zumindest in unmittelbarer Nähe zu dieser lokalisiert werden. Unter nicht permissiven (20 mM KCl) wie auch permissiven Bedingungen (100 mM KCl) zeigten mKir2.1 exprimierende Zellen, verglichen mit einem Kontrollstamm ohne mKir2.1, eine deutlich verringerte Sensitivität gegenüber dem als Indikator für das Membranpotential beschriebenen Antibiotikum Hygromycin B, was auf eine Membrandepolarisierung mit funktionellem mKir2.1 hindeutet. Die Untersuchung des Wachstums von mKir2.1 exprimierenden Stämmen bei Zugabe der bekannten Blocker von Kir2.1 Ag+, Cs+, Ba2+ und 48F10 zeigte unter K+-limitierenden Bedingungen eine signifikante Inhibierung von mKir2.1 spezifischem Wachstum. Im Zuge der Entwicklung eines standardisierten Testsystems zur Durchmusterung von potentiellen Modulatoren von Kir2.1 wurde in einem Ringtest die Übertragbarkeit dieser Wachstumstests auf andere Labore am Beispiel eines standardisierten CsCl-Test untersucht und bestätigt. Unter permissiven Bedingungen (≥ 50 mM KCl) und pH 7 führte darüber hinaus die Expression von mKir2.1 zu einer signifikanten Wachstumsinhibierung und damit zu einem weiteren mKir2.1 spezifischen Phänotyp. Diese Wachstumsinhibierung konnte durch Zugabe von CsCl und in K+-Effluxmutanten durch Zugabe von BaCl2 aufgehoben werden.
Damit konnte für diesen K+-Kanal die funktionelle heterologe Expression gezeigt werden und es wurden zwei neue, bisher nicht beschriebene Phänotypen identifiziert. Mit den konstruierten Hefestämmen steht ein pharma-/toxikologisches Testsystem zur Verfügung, für das die Sensitivität, Spezifität und der Vergleich mit dem ‚Gold Standard’ unter standardisierten Bedingungen gezeigt werden konnte.
Die Expression von HERG-cDNA führte in S. cerevisiae K+-Aufnahmemutanten zu keiner Komplementation des mutanten Wachstumsphänotyps. Bei der Expression von Fusionskonstrukten aus GFP und HERG konnte keine Lokalisation an der Zelloberfläche beobachtet werden. Auch die Konstruktion verschiedener HERG-Modifikationen im Sinne eines verbesserten Membran- ‚Targeting’ und/oder verbessertem ER-Exports konnten keine Lokalisierung in oder in der Nähe der Plasmamembran sowie keine erfolgreiche Komplementation bewirken.
Schlagwörter
Saccharomyces cerevisiae, Kaliumkanäle, hERG, mKir2.1, heterologe Expression
Klassifikation (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieHasenbrink-Martini, Guido: Aufbau eines pharma-/toxikologischen Testsystems für die Säuger-Kaliumkanäle mKir2.1 und hERG mit Hilfe des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. - Bonn, 2007. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-10925
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-10925
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Ziel der Arbeit war die Charakterisierung von hERG und dem zum humanen Kir2.1-Protein orthologen Kir2.1-Protein aus der Maus in Saccharomyces cerevisiae K+-Transportmutanten. Die funktionelle Expression von chromosomal als auch episomal exprimierter mKir2.1-cDNA komplementierte den mutanten Wachstumsphänotyp unter nicht permissiven Bedingungen (3-10 mM KCl) in Abhängigkeit vom externen pH. GFP-mKir2.1 Fusionsproteine konnten in der Plasmamembran oder zumindest in unmittelbarer Nähe zu dieser lokalisiert werden. Unter nicht permissiven (20 mM KCl) wie auch permissiven Bedingungen (100 mM KCl) zeigten mKir2.1 exprimierende Zellen, verglichen mit einem Kontrollstamm ohne mKir2.1, eine deutlich verringerte Sensitivität gegenüber dem als Indikator für das Membranpotential beschriebenen Antibiotikum Hygromycin B, was auf eine Membrandepolarisierung mit funktionellem mKir2.1 hindeutet. Die Untersuchung des Wachstums von mKir2.1 exprimierenden Stämmen bei Zugabe der bekannten Blocker von Kir2.1 Ag+, Cs+, Ba2+ und 48F10 zeigte unter K+-limitierenden Bedingungen eine signifikante Inhibierung von mKir2.1 spezifischem Wachstum. Im Zuge der Entwicklung eines standardisierten Testsystems zur Durchmusterung von potentiellen Modulatoren von Kir2.1 wurde in einem Ringtest die Übertragbarkeit dieser Wachstumstests auf andere Labore am Beispiel eines standardisierten CsCl-Test untersucht und bestätigt. Unter permissiven Bedingungen (≥ 50 mM KCl) und pH 7 führte darüber hinaus die Expression von mKir2.1 zu einer signifikanten Wachstumsinhibierung und damit zu einem weiteren mKir2.1 spezifischen Phänotyp. Diese Wachstumsinhibierung konnte durch Zugabe von CsCl und in K+-Effluxmutanten durch Zugabe von BaCl2 aufgehoben werden.
Damit konnte für diesen K+-Kanal die funktionelle heterologe Expression gezeigt werden und es wurden zwei neue, bisher nicht beschriebene Phänotypen identifiziert. Mit den konstruierten Hefestämmen steht ein pharma-/toxikologisches Testsystem zur Verfügung, für das die Sensitivität, Spezifität und der Vergleich mit dem ‚Gold Standard’ unter standardisierten Bedingungen gezeigt werden konnte.
Die Expression von HERG-cDNA führte in S. cerevisiae K+-Aufnahmemutanten zu keiner Komplementation des mutanten Wachstumsphänotyps. Bei der Expression von Fusionskonstrukten aus GFP und HERG konnte keine Lokalisation an der Zelloberfläche beobachtet werden. Auch die Konstruktion verschiedener HERG-Modifikationen im Sinne eines verbesserten Membran- ‚Targeting’ und/oder verbessertem ER-Exports konnten keine Lokalisierung in oder in der Nähe der Plasmamembran sowie keine erfolgreiche Komplementation bewirken.},
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Ziel der Arbeit war die Charakterisierung von hERG und dem zum humanen Kir2.1-Protein orthologen Kir2.1-Protein aus der Maus in Saccharomyces cerevisiae K+-Transportmutanten. Die funktionelle Expression von chromosomal als auch episomal exprimierter mKir2.1-cDNA komplementierte den mutanten Wachstumsphänotyp unter nicht permissiven Bedingungen (3-10 mM KCl) in Abhängigkeit vom externen pH. GFP-mKir2.1 Fusionsproteine konnten in der Plasmamembran oder zumindest in unmittelbarer Nähe zu dieser lokalisiert werden. Unter nicht permissiven (20 mM KCl) wie auch permissiven Bedingungen (100 mM KCl) zeigten mKir2.1 exprimierende Zellen, verglichen mit einem Kontrollstamm ohne mKir2.1, eine deutlich verringerte Sensitivität gegenüber dem als Indikator für das Membranpotential beschriebenen Antibiotikum Hygromycin B, was auf eine Membrandepolarisierung mit funktionellem mKir2.1 hindeutet. Die Untersuchung des Wachstums von mKir2.1 exprimierenden Stämmen bei Zugabe der bekannten Blocker von Kir2.1 Ag+, Cs+, Ba2+ und 48F10 zeigte unter K+-limitierenden Bedingungen eine signifikante Inhibierung von mKir2.1 spezifischem Wachstum. Im Zuge der Entwicklung eines standardisierten Testsystems zur Durchmusterung von potentiellen Modulatoren von Kir2.1 wurde in einem Ringtest die Übertragbarkeit dieser Wachstumstests auf andere Labore am Beispiel eines standardisierten CsCl-Test untersucht und bestätigt. Unter permissiven Bedingungen (≥ 50 mM KCl) und pH 7 führte darüber hinaus die Expression von mKir2.1 zu einer signifikanten Wachstumsinhibierung und damit zu einem weiteren mKir2.1 spezifischen Phänotyp. Diese Wachstumsinhibierung konnte durch Zugabe von CsCl und in K+-Effluxmutanten durch Zugabe von BaCl2 aufgehoben werden.
Damit konnte für diesen K+-Kanal die funktionelle heterologe Expression gezeigt werden und es wurden zwei neue, bisher nicht beschriebene Phänotypen identifiziert. Mit den konstruierten Hefestämmen steht ein pharma-/toxikologisches Testsystem zur Verfügung, für das die Sensitivität, Spezifität und der Vergleich mit dem ‚Gold Standard’ unter standardisierten Bedingungen gezeigt werden konnte.
Die Expression von HERG-cDNA führte in S. cerevisiae K+-Aufnahmemutanten zu keiner Komplementation des mutanten Wachstumsphänotyps. Bei der Expression von Fusionskonstrukten aus GFP und HERG konnte keine Lokalisation an der Zelloberfläche beobachtet werden. Auch die Konstruktion verschiedener HERG-Modifikationen im Sinne eines verbesserten Membran- ‚Targeting’ und/oder verbessertem ER-Exports konnten keine Lokalisierung in oder in der Nähe der Plasmamembran sowie keine erfolgreiche Komplementation bewirken.},
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