Identifikation und Charakterisierung differenziell exprimierter Gene in einer Mausmutanten mit prolongierter Engrailed-2 Expression mithilfe der Array-Technologie

Abstract

Die Überexpression von Engrailed-2 in den Purkinjezellen des Kleinhirns der L7En-2 Maus führt zu einem cerebellären Phänotyp, der bisher auf morphologischer Ebene gut untersucht ist, dessen genetischer, physiologischer und verhaltensphysiologischer Hintergrund aber unbekannt ist. Die L7En-2 Purkinjezellen zeigen eine Reduktion in der Differenzierung, denn sowohl die Reifung der Somata, als auch der Dendriten sind verzögert, und die somatotopisch geordnete Verschaltung der Purkinjezellen mit afferenten Moosfasern ist gestört. <br /> In dieser Arbeit wurde nach potenziellen genetischen Ursachen für die beobachteten morphologischen Anomalien gesucht. Mithilfe der Array-Technologie wurden in drei verschiedenen Entwicklungsstufen insgesamt 620 Gene identifiziert, die in der L7En-2 Maus im Vergleich zur Wildtyp-Maus differenziell reguliert wurden. Um die Ergebnisse der Array-Daten zu verifizieren und gleichzeitig potenzielle molekulare Effektoren für die beobachteten morphologischen Änderungen zu identifizieren, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Expression von fünf Genen genauer untersucht. Das Calcium-bindenen Protein Parvalbumin (Pvalb) zeigte eine verzögerte Expression um den Postnataltag sieben. Die Korrelation des Expressionsmusters mit der Entwicklungsstörung der Dendriten deutet auf eine Funktion von Parvalbumin bei der Dendritogenese hin. Für das Transmembran-Protein Tetraspanin-5 (Tspan5) wurde eine Zelltyp-spezifische, reduzierte Expression gezeigt, die vom Postnataltag neun bis in die adulten Stadien andauerte. Die genaue Funktion von Tetraspanin-5 ist bisher noch nicht aufgeklärt, jedoch kann aufgrund der Funktion von anderen Tetraspaninen eine Beteiligung von Tetraspanin-5 bei der morphologischen Ausdifferenzierung von Zellen postuliert werden. In eine ähnliche funktionelle Klasse von Proteinen wird das Aktin-bindende Protein Metastasen Suppressorgen 1 (Mtss1) gruppiert. Dieses Mtss1 Gen wurde ähnlich dem Expressionsmuster von Parvalbumin und Tetraspanin-5 Zelltyp-spezifisch um den Postnataltag sieben in den Purkinjezellen herunterreguliert.<br /> Das Neuropeptid Cholecystokinin (CCK) konnte als viertes Gen identifiziert werden, dessen Expression spezifisch in Purkinjezellen der L7En-2 Mäuse herunterreguliert wurde. Im Unterschied zu den bisher beschriebenen Genen wird CCK permanent während der gesamten postnatalen Kleinhirnentwicklung differenziell exprimiert. Unterschiedlich ist ebenfalls die bisher bekannte Funktion von CCK. In subkortikalen Gehirnregionen moduliert CCK die neuronale Signalübertragung. Auch wenn bisher eine Funktion von CCK im Kleinhirn unbekannt ist, so ist aus dem endokrinen System bekannt, dass CCK die Oxytocinsekretion reguliert. Oxytocin-Spiegel und Signaltransduktionsmechanismen werden als zentrale Regulatoren der sozialen Kommunikation angesehen. Gestörte Oxytocinlevel verursachen entsprechend autistische Symptome. Interessant wird dieser Zusammenhang zwischen CCK und Autismus durch den Befund, dass auch Engrailed—2-Mutationen mit autistischen Erkrankungen assoziiert worden sind. Unabhängig von den Array-Daten wurden Gene untersucht, die mit der axonalen Verschaltung des Kleinhirns in Zusammenhang gebracht wurden. Für das sezernierte Signalmolekül Semaphorin 3A konnte in den Purkinjezellen der L7En-2 Tiere eine Zelltyp-spezifische Reduktion der Expression in sieben Tage alten und adulten Tieren gezeigt werden. Da Semaphorin 3A Moosfasernwachstum inhibiert, könnte es für die beobachteten Veränderungen in der Verschaltung des L7En-2 Kleinhirnkortex verantwortlich sein. Daneben konnte hier gezeigt werden, dass der Rezeptor Neuropilin 1 und das intrazelluläre Signalmolekül CRMP 5 in postmitotischen Körnerzellen der äußeren Körnerzellschicht exprimiert werden. Auch wenn funktionelle Untersuchungen noch fehlen, erlauben diese Befunde die Spekulation, dass das Semaphorin-Signalsystem einen Einfluss auf die gerichtete Wanderung der Körnerzellen hat. <br /> In einer Clusteranalyse zeigte sich, dass die differenziell exprimierten Gene, die in zelluläre Transportprozesse, in die Lokalisation von Proteinen und den Lipidmetabolismus eingreifen, stark überrepräsentiert waren. Diese Beobachtungen würden nicht nur mit dem morphologischen Phänotyp, sondern auch mit der Funktion der bereits verifizierten Gene korrelieren. Ein korrekter und zielgerichteter Transport von Vesikeln und Proteinen, und damit eine korrekte Verteilung von Membranorganellen in der Zelle sind für die Ausbildung der Fortsätze an der richtigen Stelle und im richtigen Ausmaß entscheidend. Darüber hinaus sind zelluläre Transportprozesse essenziell für die axonale Verschaltung des Zentralnervensystems.<br /> Die hier durchgeführten Arbeiten zeigen, dass Engrailed-2 ein wichtiger Faktor sein könnte, der den zellulären Transport steuert und damit Einfluss auf die neuronale Entwicklung und neuronale Kommunikation nimmt. Die Daten unterstützen ferner die Vermutung, dass Engrailed-2 an der Ausprägung des Autismus beteiligt ist, und liefern eine experimentelle Basis, wie zumindest einige Gene aus dem Pool an Autismus-assoziierten Genen miteinander verwoben sein könnten.