Schulze, Heike: Humane saure Ceramidase : Baculovirus-Expression, Prozessierung, Reinigung, Charakterisierung und Strukturanalyse mittels MALDI-TOF und ESI-Massenspektrometrie. - Bonn, 2007. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-11646
@phdthesis{handle:20.500.11811/3142,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-11646,
author = {{Heike Schulze}},
title = {Humane saure Ceramidase : Baculovirus-Expression, Prozessierung, Reinigung, Charakterisierung und Strukturanalyse mittels MALDI-TOF und ESI-Massenspektrometrie},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2007,
note = {Die humane saure Ceramidase katalysiert den letzten Schritt des lysosomalen Sphingolipid-Abbaus, die Hydrolyse von Ceramid zu Sphingosin und Fettsäure. Mutationen im Gen der sauren Ceramidase führen zur Farberschen Krankheit. Die saure Ceramidase ist ein heterodimeres Glykoprotein, das nach Abspaltung einer Signalsequenz aus einem monomeren Vorläufer-Protein durch Spaltung zwischen Isoleucin121 und Cystein122 hervorgeht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, ausschliesslich prozessiertes, aktives Enzym im Milligramm-Maßstab herzustellen. Infektion von Sf-9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus, der die cDNA des Vorläufers der humanen sauren Ceramidase enthält, führte zu einem Gemisch von Vorläufer und prozessierter saurer Ceramidase im Expressionsüberstand. Der Vorläufer wurde durch Ansäuern des Expressionsüberstands prozessiert und die reife saure Ceramidase in einem 3-Schritt-Verfahren bis annähernd zur Homogenität gereinigt.
Durch massenspektrometrische Analyse der tryptischen Glykopeptide konnte die N-Glykosylierung an 4 der 6 potentiellen N-Glykosylierungsstellen identifiziert werden. An N152 wurde eine fucosylierte Core-Struktur GlcNAc2(Fuc)Man3 identifiziert. N174 und N238 liegen wahrscheinlich auch glykosyliert vor, da Hinweise auf die entsprechenden deglykosylierten Peptide gefunden wurden. Die glykosylierte Spezies wurden nicht identifiziert. N265 wurde im MALDI-Massenspektum sowohl unglykosyliert, als auch mit GlcNAc2Man3 nachgewiesen. An N321 liegt eine heterogene Glykosylierung aus GlcNAc2(Fuc)Man3 und GlcNAc2Man3 vor. N327 ist nicht glykosyliert.
Die Disulfidverknüpfung der insgesamt 6 Cystein-Reste der sauren Ceramidase konnte in der vorliegenden Arbeit aufgeklärt werden. Durch proteolytische Spaltung und massenspektrometrische Analyse der durch reversed phase-HPLC getrennten Peptide wurden Disulfidbrücken zwischen C10 und C319, zwischen C122 und C271 und zwischen C367 und C371 nachgewiesen. Die Verknüpfung von C122 wiederspricht der Vermutung, dass es sich bei C122 um ein freies Cystein im katalytisch aktiven Zentrum des Enzyms handelt. Ob C122 in der gesamten Proteinpräparation als Teil einer Disulfid-Brücke vorliegt, oder ob ein kleiner Teil der Proteinpräparation über ein freies C122 verfügt, konnte mit den angewendeten Methoden nicht festgestellt werden.
Tritium-markiertes 2N-(p-(3-(Trifluormethyl)diazirinyl)phenyl)propanoyl-sphinganin wurde auf seine Eignung, als Photoaffinitätsligand kovalent an Aminosäurereste im aktiven Zentrum der sauren Ceramidase zu binden, untersucht. Das Sphinganin-Derivat wurde jedoch von der sauren Ceramidase nicht als Substrat erkannt, was ein Vorraussetztung für die Markierung des aktiven Zentrums ist. Es konnte lediglich das Wasserinsertionsprodukt des Photoaffinitätsliganden nachgewiesen werden.
N-Bromacetylsphingosin wurde bereits als kovalenter Inhibitor der sauren Ceramidase beschrieben. Allerdings erfolgt die Reaktion mit dem Enzym unspezifisch. Es konnte daher keine Proteinregion isoliert werden, die bevorzugt mit dem Liganden reagiert.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/3142}
}

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