Der Stoffwechsel der Sphingolipide

Abstract

Die Dihydroceramid-4-Desaturase ist ein membrangebundenes Enzym höherer Eukaryonten, das auf der zytosolischen Seite des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Sie katalysiert mit der Einführung der 4,5-(<i>E</i>)-Doppelbindung in das Sphingoid-Rückgrat den letzten Schritt der Ceramid-Biosynthese. <br /> Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss zweier Substratanaloga der Dihydroceramid-4-Desaturase auf den Sphingolipidstoffwechsel humaner Keratinozyten untersucht. Bei den beiden Verbindungen handelte es sich um modifizierte Dihydroceramide mit einem Cyclopropyl-Rest (Cp-DHC) bzw. einer Dreifachbindung (Db-DHC) zwischen den Positionen 5 und 6 der Sphingoidbase. Nach enzymatischer Bildung eines Radikals in Position 4 und Umlagerung der reaktiven Zwischenstufe ist die Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Cp-DHC bzw. Db-DHC und der Dihydroceramid-4-Desaturase und damit eine Hemmung des Enzyms denkbar. <br /> Zunächst wurden metabolische Markierungsstudien mit L-[3-¹⁴C]-Serin, dem radioaktiv markierten Ausgangsmolekül der Ceramid-Biosynthese, und radiomarkierten zellgängigen Analoga von Dihydroceramid und Ceramid unter Zusatz verschiedener Konzentrationen Cp-DHC und Db-DHC an differenzierten Keratinozyten durchgeführt. Dabei konnte eine von der Konzentration der beiden Verbindungen abhängige Zunahme des Dihydroceramid- und eine Abnahme des Ceramidanteils nachgewiesen werden. Dieser Befund spricht für eine Inhibierung der Dihydroceramid-4-Desaturase. Bei der [3-¹⁴C]-Serin-Markierung differenzierter Keratinozyten zeigte sich in Gegenwart von Cp-DHC bzw. Db-DHC zudem eine Erhöhung der Menge biosynthetisierten Phytoceramids. Außerdem wurden als Stoffwechselprodukte von Cp-DHC und Db-DHC Sphingomyelin-Analoga und mit verschiedenen endogenen Fettsäure acylierte N-Acyl-Metabolite massenspektrometrisch identifiziert. <br /> Im Gegensatz zu Ceramid ruft Dihydroceramid in der Regel keine antimitogenen Effekte hervor. Daher wurde untersucht, welche Konsequenzen die durch Cp-DHC hervorgerufene Abnahme des Ceramid- zugunsten des Dihydroceramidanteils auf den Übergang von Proliferation zu Differenzierung in humanen Keratinozyten hat. Dazu wurde die Expression von Genen einiger Proteine, die am Ceramidstoffwechsel und an der Differenzierung von Keratinozyten beteiligt sind, mittels <i>real-time</i> Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Dabei zeigte sich, dass während der durch 1.1 mM Ca²⁺ und 10 µM Linolsäure induzierten Differenzierung der Keratinozyten in Gegenwart von Cp-DHC die Expressionsraten von Differenzierungsmarkerproteinen herunter- und die eines Proliferationsmarkers hochreguliert wurde. Außerdem führte der Zusatz von Cp-DHC zu einer Hochregulierung der Expressionsrate aller untersuchten Ceramid-metabolisierenden Enzyme, wodurch der Zellstoffwechsel in Richtung einer vermehrten Bildung von Sphingosin dirigiert wurde, das nach Phosphorylierung mitogene Effekte vermittelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Mangel an 4,5-ungesättigten Sphingolipiden zu einer Störung der Differenzierung führt, die zur Folge hat, dass die Keratinozyten in einem proliferierenden Zustand verbleiben. <br /> Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur Spinocerebellärer Ataxie Typ 2 (SCA2) durchgeführt. SCA2 gehört zur Gruppe der neurodegenerativen Polyglutaminkrankheiten. Das bei SCA2 betroffene Protein Ataxin-2 wird ubiquitär exprimiert. Seine Funktion und der zur Erkrankung führende Pathomechanismus sind unbekannt. Da sich in jüngerer Zeit die Hinweise mehren, dass Polyglutaminkrankheiten mit Störungen des Lipidstoffwechsels verbunden sind, wurde die Lipidzusammensetzung in Hirngewebe einer SCA2-Patientin analysiert. Dazu wurden Proben aus dem Cortex, der bei SCA2 weitgehend erhalten bleibt, und aus dem Kleinhirn, das von der Krankheit hauptsächlich betroffen ist, untersucht. Dabei ergab sich als wichtigstes Ergebnis ein starker Mangel an Lipiden, die typischerweise im Myelin vorkommen, im Kleinhirn der Patientin. Nur unwesentlich verändert war dagegen der Gehalt an Gangliosiden, die nur in geringen Konzentrationen im Myelin, sondern hauptsächlich in der neuronalen Plasmamembran und damit in der grauen Hirnsubstanz zu finden sind. Die Ergebnisse sind Zeichen einer Demyelinisierung im Kleinhirn der Patientin. <br /> Während SCA2-Patienten u. a. an einer starken Reduktion des Unterhautfettgewebes leiden, zeigen drei Monate alte SCA2-<i>knock out</i>-Mäuse Fettleibigkeit und Insulinresistenz. Dies weist darauf hin, dass Ataxin-2 eine regulierende Funktion in den durch Insulin vermittelten Signalwegen haben könnte. Zur Klärung der Frage, ob die für SCA2 verantwortliche Expansion des Polyglutaminstrangs in Ataxin-2 zu einem Funktionsverlust des Proteins führt, wurden die Lipidzusammensetzung in Cortex und Kleinhirn der<i> knock out</i>-Mäuse analysiert. <br /> Dabei zeigte sich im Kleinhirn der knock out-Mäuse kein Mangel Myelin-typischer Lipide, sondern im wesentlichen ein deutlich erhöhter Gangliosidgehalt. Der Verlust von Ataxin-2 in Mäusen führt also nicht zu den gleichen Lipidveränderungen im Gehirn wie die Existenz von variantem Ataxin-2 mit expandierter Polyglutaminkette in SCA2-Patienten. Da jedoch erhöhte Konzentrationen von Ceramid oder höheren Sphingolipiden in verschiedenen Geweben häufig mit der Vermittlung von Insulinresistenz in Zusammenhang stehen, bekräftigen die im Kleinhirn der SCA2-<i>knock out</i>-Mäuse gefunden erhöhten Gangliosidmengen das Bild von Ataxin-2 als einen Regulator der durch Insulin vermittelten Signalwege.