Molekulare Basis der Aktivierung und Modulation des P2Y₂-Nukleotid-Rezeptors

Abstract

Der P2Y₂-Rezeptor wird durch die physiologischen Nukleotide ATP und UTP aktiviert und löst eine Signalübertragung über die Phospholipase Cß und Inositol-1,4,5-trisphosphat aus, die schließlich zu intrazellulären Calciumanstiegen führt. Er spielt eine wichtige Rolle bei bestimmten pathophysiologischen Prozessen wie der Befeuchtung von Epithelien, Atherosklerose, Zellproliferation und neurodegenerativen Erkrankungen. Daher sind der P2Y₂-Rezeptor sowie auch andere Subtypen der P2Y-Rezeptor-Familie viel versprechende Arzneistoff-Targets.<br /> Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Bindungstasche des humanen P2Y₂-Rezeptors mittels zielgerichteter Mutagenese. Bisher waren lediglich drei Aminosäuren bekannt, die an der Ligandbindung und Rezeptoraktivierung des P2Y₂-Rezeptors beteiligt sind: Die positiv geladenen Aminosäuren His262, Arg265 und Arg292. <br /> Der humane P2Y₂-Rezeptor wurde mittels retroviraler Transfektion funktionell in 1321N1-Astrozytomzellen exprimiert. Die Aktivierbarkeit der Rezeptoren wurde durch intrazelluläre Calciummessungen mit einem fluorimetrischen Assay im 96-Well-Format untersucht. Zur Bestimmung der Expressionsraten der Rezeptoren wurde ein Zelloberflächen-ELISA entwickelt, bei dem monoklonale Antikörper gegen das N-terminale HA-Tag des Rezeptors zur Detektion dienten. Durch die chemische Reduktion mittels Dithiothreitol (DTT) wurde gezeigt, dass die Disulfidbrücken zwischen Cys25 und Cys278 sowie zwischen Cys106 und Cys183 essentiell für die Aktivierbarkeit des P2Y₂-Rezeptors sind. Dies konnte durch Mutagenese einzelner Cysteine bestätigt werden. Folgende Mutationen wurden in die transmembranären Helices des P2Y2-Rezeptors eingeführt: Y114A, Y118A (TM3), Y198A (TM5), S296A (TM7). Des Weiteren wurden Mutationen basischer Aminosäuren in den extrazellulären Schleifen des P2Y₂-Rezeptors durchgeführt: R177A_R180A, R177A, R180A, R194H (EL2) und R272A (EL3). Die Aminosäuren Tyr118 und Ser296 sind essentiell für die Rezeptoraktivierung. Sie bilden direkte Wechselwirkungen mit den Rezeptor-Liganden aus und sind an der Rezeptorstabilisierung beteiligt. Auch die basischen Aminosäuren im Extrazellulären Loop 2 sind direkt an der Agonistbindung beteiligt. Arg272 ist Teil einer so-genannten Meta-Bindungsstelle. An den P2Y₂-Rezeptor-Mutanten wurden des Weiteren Antagonisten mit Anthrachinonstruktur untersucht. Für die Bindung spielen die basischen Aminosäuren im Extrazellulären Loops 2 sowie die Aminosäure Tyr114 eine Rolle. Insgesammt konnte die Bindungstasche des humanen P2Y₂-Rezeptors charakterisiert werden, was zur Entwicklung und strukturellen Verbesserung von Rezeptor-Liganden führt und einer Annäherung von computergenerierten Rezeptormodellen an die Realität dient. <br /> Hohe Konzentrationen von Ammonium im Blut führen zu neurotoxischen Effekten, wie dies zum Beispiel in der Hepatischen Encephalopathie der Fall ist. Von den toxischen Auswirkungen der Ammonium-Ionen sind hauptsächlich Astrozyten nicht jedoch Neuronen betroffen. Durch hohe Konzentrationen verschiedener Ammoniumsalze wurden in 1321N1-Astrozytomzellen (EC₅₀ = 6,38 mM), nicht jedoch in NG108-15-Zellen, transiente intrazelluläre Calciumanstiege ausgelöst. Die Calcium-Ionen wurden hierbei aus intrazellulären Speichern freigesetzt. Acetat konnte in hohen Konzentrationen die Ammonium-induzierten Ca2+-Anstiege hemmen. Die Expression der Ammoniumtransporter RhBG/Rhbg und RhCG/Rhcg wurde auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR untersucht. Beide Transporter werden in NG108-15-Zellen exprimiert. In 1321N1-Astrozytomzellen konnte keine mRNA für die Ammoniumtransporter nachgewiesen werden. 1321N1-Astrozytomzellen wurden als leicht handhabbares, erstes humanes Modellsystem für die Untersuchung der Hepatischen Encephalopathie etabliert.