Saposin B und D: Heterologe Expression in <i>Pichia pastoris</i> und biophysikalische Charakterisierung

Abstract

Die vier Saposine (Saps) A-D sind kleine, enzymatisch inaktive Glykoproteine, die in Lysosomen lokalisiert sind. Trotz ihrer hohen Sequenzhomologie zeigen sie als membranaktive, wasserlösliche Lipidbindungs- und Transferproteine unterschiedliche Spezifitäten und Mechanismen.<br /> Zusammen mit dem GM2-Aktivatorprotein sind die Saps essentielle Cofaktoren für den Abbau von Glykosphingolipiden (GSL) mit kurzen Oligosaccharidketten, die sie an der Membran-Wasser-Grenzfläche für Exohydrolasen zugänglich machen. Nach einer gut gesicherten Hypothese erreichen die für den Abbau bestimmten Bestandteile der Zellmembran nach ihrer Endozytose intraendosomale und –lysosomale Membranstrukturen. Letztere unterscheiden sich von der begrenzenden Membran durch das Fehlen einer schützenden Glykokalix, sie enthalten fast kein Cholesterol, dafür aber das lysosomale Markerlipid Bis(monoacylglycero)phosphat (BMP). <br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurde funktionales Sap-B und -D heterolog in der methylotrophen Hefe <i>Pichia pastoris</i> exprimiert, so daß eine Kontamination mit anderen Saps ausgeschlossen werden konnte. Ihre Expression und Aufreinigung wurden zur Steigerung der Ausbeute an die Durchführung in einem Bioreaktor angepaßt. Die Interaktion der rekombinanten Saps mit den intralysosomalen, vesikulären Membranen wurde an Liposomen nachgestellt und mittels Dynamischer Lichtstreuung und Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie untersucht; für letztere Methode wurden die Liposomen reversibel immobilisiert. <br /> Während Sap-B die Größe von Liposomen in Suspension nicht veränderte, ließ Sap-D BMP-haltige Liposomen bei saurem pH aggregieren. Sowohl Sap-B als auch Sap-D banden an immobilisierte Liposomen. Glykosyliertes Sap-B störte bei saurem pH-Wert die Membranintegrität und löste so Lipide aus den Liposomen. Gefördert wurde dieser Prozeß durch die Anwesenheit von BMP; Cholesterol dagegen stabilisierte die Liposomen. Bei unglykosyliertem Wildtyp-Sap-B und zuckerfreien Varianten mit veränderter Glykosylierungsequenz war die Fähigkeit zur Lipidextraktion vermindert. Damit konnte zum ersten mal eine Funktion für die Glykosylierung von Sap-B unter physiologischen Bedingungen gezeigt werden. Eine dieser Sap-B-Varianten, bei der Asparagin 215 durch Histidin ersetzt ist, verursacht beim Menschen eine tödliche Sphingolipidspeicherung, die durch ein Krankheitsbild ähnlich der Metachromatischen Leukodystrophie gekennzeichnet ist. <br /> Sap-D konnte nur in der unglykosylierten Form exprimiert werden, die im liposomalen in vitro Assay, aber auch in Zellkultur aktiv war, und das erstmals kristallisiert werden konnte. Die Fähigkeit zur Lipidmobilisierung war deutlich geringer ausgeprägt als bei Sap-B und konnte durch den Austausch einer positiv geladenen Aminosäure (Arginin 15 gegen Glutamat), die im für die Membranbindung vermutlich relevanten Bereich des Proteins liegt , vollständig ausgeschaltet werden.