Heisig, Fabian: Synthese neuer, funktionalisierter BODIPY-Fluorophore zur Fluoreszenzmarkierung von Membranrezeptor-Liganden. - Bonn, 2007. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-12135
@phdthesis{handle:20.500.11811/3160,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-12135,
author = {{Fabian Heisig}},
title = {Synthese neuer, funktionalisierter BODIPY-Fluorophore zur Fluoreszenzmarkierung von Membranrezeptor-Liganden},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2007,
note = {Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Strukturen bei der Untersuchung von biologischen Zielmolekülen stellt eine wertvolle Alternative zu Radioligand-bindungsstudien dar. Um diese Methoden anwenden zu können, bedarf es neben der nötigen technischen Ausrüstung der entsprechenden fluoreszenzmarkierten Verbindungen. In der vorliegenden Arbeit wurden BODIPY-Fluorophore verwendet, da diese vielen anderen Fluorophoren hinsichtlich pH- und Photostabilität deutlich überlegen sind. BODIPY-Derivate sind kommerziell von der Firma Molecular Probes erhältlich. Ihr präparativer Einsatz verbietet sich aber auf Grund des hohen Preises. Die im Rahmen dieser Arbeit dargestellten BODIPY-Derivate sind deutlich kleiner als die kommerziell erhältlichen BODIPY-Derivate (s.Verbindung 48) und durch die gute Abgangsgruppe leicht derivatisierbar. Die mittels Eintopfsynthese erhältlichen 8 (ω-Bromalkyl)-4,4-difluor-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen- (BODIPY ) Derivate 21-26 konnten erfolgreich dargestellt werden. Die Ausbeute von 24 konnte durch die Durchführung der Reaktion in einem Druckgefäß bei hohen Temperaturen deutlich erhöht werden. Diese Bedingungen ließen sich jedoch nicht auf die Verbindungen 21-23 und 25-26 übertragen. Die Darstellung der präparativ wichtigen 8 (ω-Aminoalkyl)-4,4-difluor-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene 29-33 konnte erheblich verbessert werden. Die Umsetzung der BODIPY-Derivate 22-26 mit 7N-ammoniakalischer Methanol-Lösung führte unter Mikrowellenbestrahlung in hohen Ausbeuten (91-57 %) bzw. befriedigenden Ausbeuten (27 %) zu den Derivaten 29-33 (Abb. 66). Die rot markierten Verbindungen sind neu und wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals beschrieben.Die Reaktionszeit konnte erheblich verkürzt (20 min) und die Aufarbeitung deutlich vereinfacht werden. Durch kapilliarelektrophoretische Reinheitsuntersuchungen konnte die hohe Reinheit der neu dargestellten Amino-BODIPY-Derivate nachgewiesen werden. In einigen Fällen ist es möglich, dass die Einführung der BODIPY-Fluorophore, durch ihre hohe Lipophilie zu einer geringen Löslichkeit der Liganden in den gängigen Pufferlösungen der Testsysteme führt. Daher wurden die BODIPY-Derivate 34 und 35 entwickelt, die durch die Sulfonsäuregruppen wasserlöslich sind (Abb. 66). Verbindung 35 lag auf Grund der CH-Acidität der exocyclischen Methylengruppe zunächst in einer nicht fluoreszierenden Form vor. Analog zu den publizierten Ergebnissen, ließ sich die fluoreszierende Form durch Erniedrigung des pH-Wertes zurückgewinnen.
Die neu dargestellten BODIPY-Derivate wurden für die Markierung von Adenosinrezeptorliganden verwendet. Bei der Entwicklung eines fluoreszenz-markierten A1-Agonisten musste das Adenosin zunächst so modifiziert werden, dass neben der Bindungsfähigkeit zum A1-Rezeptor auch eine passende Verknüpfungsstelle für die Kupplung mit einem BODIPY-Fluorophor vorhanden war. Für diesen Zweck wurden die Adenosinderivate 59 und 60 dargestellt, indem 6 Chlor-2´,3´,5´-triacetylribofuranosylpurin mit 6-Aminohexansäure bzw. 4 (Aminomethyl)benzoesäure verknüpft wurden. Beide Verbindungen konnten in sehr guten (59, 92%) bzw. guten (60, 50%) Ausbeuten und in hoher Reinheit dargestellt werden. Die Umsetzung der Carbonsäurefunktion mit den Aminogruppen des BODIPY-Derivates 33 führte zu den fluoreszenzmarkierten A1-Agonisten 65 und 66. Beide Verbindungen zeigen in Radioligandbindungsstudien hohe Affinitäten zum A1-Rezeptor und ausreichende Selektivitäten gegenüber den A2A-, A2B- und A3-AR. In GTPγS-Experimenten konnte gezeigt werden, dass beide Verbindungen Vollagonisten sind.
Bei der Entwicklung eines fluoreszenzmarkierten A2A-AR-Agonisten wurde zunächst eine Methode entwickelt, um Chloradenosin in hoher Reinheit darzustellen. Auf die zunächst vorgesehene Verknüpfung von Chloradenosin mit einem BODIPY-Derivat wurde verzichtet, da alternativ Verbindung 82 durch Umsetzung von Thioadenosin mit 22 in Dimethylformamid unter Zusatz von Natriumethanolat dargestellt werden konnte. Die Verbindung besitzt keine Affinität zu den Adenosinrezeptoren und daher ist zu vermuten, dass der BODIPY-Fluorophor zu voluminös für die Bindungstasche ist. 82 zeigt die Schwierigkeiten bei der Entwicklung fluoreszenzmarkierter Liganden, da durch die Einführung eines Fluorophors die Bindungseigenschaften der Liganden beeinflusst werden können. Die Entwicklung fluoreszenzmarkierter A2B-Antagonisten gelang durch die Umsetzung der A2B-Antagonisten 87, 90 und 91 mit verschiedenen BODIPY-Fluorophoren. Die Verbindungen zeigen z.T. gute Affinitäten zum A1-Rezeptor (94, 96, 106) und besitzen keine oder nur geringe Affinitäten zum A2A-AR und zum A3-AR. Erste Versuche an humanen A2BAR zeigen hohe Affinitäten der neu dargestellten Verbindungen. So besitzt Verbindung 100 mit einem Ki-Wert von 4.1 nM eine hohe Affinität zum A2BAR und ausreichende Selektivitäten zum A1 (95fach) und hohe Selektivitäten zum A2AAR und A3AR (>250fach).In spektroskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenzeigenschaften aller fluoreszenzmarkierten AR-Liganden denen der reinen BODIPY-Derivate entsprechen. Die hohe Reinheit der neu dargestellten fluoreszenzmarkierten Liganden konnte mit Hilfe der Kapillarelektrophorese mit Messungen bei 260 nm und 495 nm bewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde des Weiteren die Verknüpfung des P-Glykoprotein-Liganden Hoechst 33258 mit einem BODIPY-Derivat durchgeführt. Die direkte Verknüpfung der beiden Substanzen war nicht möglich, so dass eine De-Novo-Synthese der Hoechst-Verbindung erforderlich war, um eine Verknüpfungsstelle in die Struktur einzubauen (113). Die von Ebrahimi et al. und Reddy et al. publizierte De-novo-Synthese der Verbindung konnte deutlich vereinfacht werden.158,159 Die Kupplung der Hoechst-Verbindung 113 mit den BODIPY-Derivaten 31 und 32 führte zu den Verbindungen 128 und 129. Verbindung 128 zeigte in ersten Untersuchungen das gleiche pharmakologische Profil wie Hoechst 33258 während Verbindung 129 schwächer aktiv war.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/3160}
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