Rezeptorepitop-Abhängigkeit der Bindung muskarinischer allosterischer Modulatoren unter verschiedenen ionalen Bedingungen

Abstract

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Es sind fünf verschiedene Subtypen von Muskarinrezeptoren bekannt, die alle neben der orthosterischen Bindungsstelle, an die der endogene Agonist Acetylcholin bindet, ein weiteres Bindungsareal besitzen, an das sich allosterische Modulatoren anlagern können. Dadurch kann die Rezeptorbindung orthosterischer Liganden moduliert werden. Viele allosterische Modulatoren weisen die höchste Affinität zum M₂-Subtyp und die niedrigste zum M₅-Subtyp auf. In Rezeptormutagenese-Studien waren zwei Aminosäuren identifiziert worden, die für die M₂/M₅-Subtypselektivität allosterischer Modulatoren wichtig sind: M₂¹⁷⁷Tyrosin und M₂⁴²³Threonin. Das in allen fünf Subtypen konserviert vorliegende Epitop M₂⁴²²Tryptophan war als wichtig für die subtypunabhängige Basisaffinität allosterischer Modulatoren beschrieben worden. Da die Experimente, die zur Entdeckung der genannten Epitope führten, unter den artifiziellen Inkubationsbedingungen eines 5 mM Na, K, P_i-Puffers</nobr> worden waren und da die Bindungsaffinität vieler allosterischer Modulatoren eine ausgeprägte Pufferabhängigkeit aufweist, stellte sich die Frage, ob die genannten Epitope unter physiologischeren Pufferbedingungen weiterhin bindungsrelevant sind. <br /> Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden ein in seiner Wirksamkeit stark pufferabhängiger Modulator - Gallamin, ein mittelstark pufferabhängiger Modulator - die Alkan-bisammonium-Verbindung W84, und das wenig pufferabhängige Alcuronium sowie weitere Testsubstanzen untersucht. Rezeptorhaltige Membranhomogenate wurden von transient transfizierten COS-7-Zellen gewonnen. Neben dem 5 mM Na, K, P_i-Puffer</nobr> (4 mM</nobr>NaH₂PO₄</nobr> und 1 mM</nobr>KH₂PO₄</nobr> bei 23°C) und dem 3/50 mM</nobr> Mg-Tris-Puffer (3 mM</nobr> MgHPO₄ und 50 mM</nobr> Tris-HCl bei 37°C) wurde ein Puffer bestehend aus 10 mM</nobr> MgCl₂, 100 mM</nobr> NaCl, 10 mM</nobr> Hepes und 10 µM GDP</nobr> bei 30°C ("10 mM</nobr> Hepes-Puffer") eingesetzt. In Radioligandbindungsstudien wurde der radioaktiv markierte orthosterische Ligand [³H]N-Methylscopolamin ([³H]NMS) verwendet. Zur Ermittlung der Affinität allosterischer Modulatoren zum [³H]NMS-besetzten Rezeptor wurde in kinetischen Untersuchungen der pEC_0.5,diss-Wert bestimmt, der das Ausmaß der dissoziationsverzögernden Wirksamkeit der allosterischen Substanzen quantifiziert. Die Affinität der allosterischen Substanzen zum freien Rezeptor, quantifiziert durch die Gleichgewichtsassoziationskonstante K_A, und der Kooperativitätsfaktor a der Interaktion mit NMS wurden durch Gleichgewichtsbindungsuntersuchungen ermittelt.<br /> Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Bedeutung der drei genannten Rezeptoreptope unter allen Inkubationsbedingungen weitgehend erhalten bleibt. Die Affinität allosterischer Modulatoren wird am unbesetzten und am NMS-besetzten Rezeptor aber in unterschiedlichem Ausmaß durch den Wechsel der Inkubationsmedien beeinflusst, somit kommt es unter verschiedenen Bedingungen zu leichten Änderungen des Ausmaßes der Kooperativität der allosterischen Modulatoren mit NMS. In fast allen Fällen wird lediglich die Quantität, also die Größe des Kooperativitätsfaktors, jedoch nicht die Richtung der kooperativen Interaktion, das heißt Bindungsförderung oder -senkung, verändert. Dies deutet darauf hin, dass die Topographie der Bindung allosterischer Modulatoren an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren unter sehr verschiedenen Pufferbedingungen im Prinzip gleich bleibt, auch wenn sich die Bindungsaffinität der Modulatoren deutlich verändert.