Biochemische und genetische Analyse der Wechselwirkung von <em>Rhodococcus equi</em> mit Makrophagen

Abstract

<i>Rhodococcus equi</i> ist ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, das in Fohlen unter anderem granulomatöse Bronchopneumonie verursacht. <i>R. equi</i> vermehrt sich in Makrophagen und ist zytotoxisch für Wirtszellen. Intrazelluläre Vermehrung und Zytotoxizität von <i>R. equi</i> hängen von der Anwesenheit eines Virulenzplasmids ab. In Makrophagen residiert <em>R. equi</em> in Phagosomen, die nicht mit Lysosomen fusionieren. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurde die Kompartimentierung von <i>R. equi</i> in Makrophagen anhand gereinigter Phagosomen analysiert. <i>R. equi</i>-enthaltende Phagosomen erhielten die früh-endosomalen Marker EEA-1 und CoroninI transient und zu späteren Zeitpunkten die spät-endosomalen Proteine LAMP1 und Rab7, aber kein Cathepsin D oder pro-Cathepsin B. Phagosomen, die <i>R. equi(+)</i> enthielten, reicherten keine vATPase an und säuerten nicht an. Eine Ansäuerung von <i>R. equi</i>(+)-enthaltenden Phagosomen wurde auch nach 48 Stunden nicht beobachtet. In diesem nicht-sauren Kompartiment vermehrte sich <i>R. equi</i> intrazellulär in kommunalen Vakuolen. Rhodokokken ohne Virulenzplasmid konnten die Akquisition der vATPase und die Ansäuerung der Phagosomen dagegen nicht verhindern und sich auch nicht in Makrophagen vermehren. <br /> Um virulenzrelevante Gene des Virulenzplasmids zu identifizieren, wurde <i>R. equi</i>(-) mit Plasmiden transformiert, die große Bereiche der Pathogenitätsinsel enthielten. Rekombinante Rhodokokken, die kein VapA produzierten, konnten sich nicht in Makrophagen vermehren und waren nicht zytotoxisch. Die zusätzliche konstitutive Expression von <i>vapA</i> ermöglichte es einigen rekombinanten Stämmen sich in Makrophagen zu vermehren und Nekrose zu induzieren. Die Zytotoxizität der Bakterien war nicht von der intrazellulären Vermehrungsfähigkeit abhängig. Keiner der getesteten Stämme konnte die Fusion mit Lysosomen und die Ansäuerung der Phagosomen hemmen. Die Vermehrung rekombinanter Stämme erfolgte im Gegensatz zum Wildtyp in sauren Kompartimenten. Um die Rolle von VapA in der Zytotoxizität von <i>R. equi</i> und der veränderten Phagosomenreifung genauer zu analysieren wurde eine <i>vapA</i>-Mutante konstruiert und anschließend charakterisiert. Die <i>vapA</i>-Mutante konnte sich nicht mehr intrazellulär vermehren, war aber ebenso zytotoxisch wie der Wildtyp. Phagosomen mit <i>R. equiΔvapA</i> erhielten nach zwei Stunden die vATPase, säuerten aber nicht an und fusionierten nicht mit Lysosomen. Die phagosomale Ansäuerung konnte <i>R. equiΔvapA</i> zu späten Zeitpunkten allerdings nicht mehr verhindern. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lässt sich sagen, dass die Zytotoxizität, die intrazelluläre Vermehrung und die veränderte Phagosomenreifung von <i>R. equi</i>(+) voneinander unabhängige Prozesse sind, in denen <i>VapA</i> und wahrscheinlich weitere Vap-Proteine eine zentrale Rolle einnehmen.