Untersuchungen zur Cre-Proteintransduktion in murine embryonale Stammzellen und Etablierung einer membranpermeablen Variante des Homeobox-Proteins Nanog zur Modulation von Stammzelleigenschaften

Abstract

Das Homeobox-Protein Nanog ist eine Schlüssel-Determinante zur Selbsterneuerung und Pluripotenzerhaltung von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen). Im Verlauf dieser Dissertation wurde eine zellmembranpermeable Variante des Nanog-Proteins etabliert, um ein Werkzeug zu schaffen, mit dem sich die Funktion des Proteins in pluripotenten und differenzierten Zellen charakterisieren lässt. Bei der hierfür angewendeten Methode der Protein-Transduktion wird keine genetische Information in Zellen transferiert, sondern rekombinant hergestelltes Protein. Dieses ist genetisch mit der Protein-Transduktionsdomäne TAT fusioniert, welche die Membranpermeabilität vermittelt.<br /> Grundlegende Erkenntnisse zur Protein-Transduktion in murine ES-Zellen wurden anhand der transduzierbaren Cre Rekombinase HTNCre (His-TAT-NLS-Cre Fusionsprotein) gewonnen. Dazu wurde zunächst das Präparationsprotokoll von HTNCre optimiert und eine Aufbewahrungslösung etabliert, in welcher das Protein mit einer Konzentration von 200 – 450 μ stabil gelagert werden kann. Mit dieser Lösung lässt sich das Ansetzen des Transduktionsmediums stark vereinfachen, da die üblichen Arbeitskonzentrationen zwischen 0,5 und 10 μ liegen, und das Protein ohne weitere Dialyseschritte in das Zielmedium verdünnt werden kann.<br /> Anhand von Reporterzelllinien ließen sich die mit HTNCre induzierten Rekombinationsereignisse zuverlässig quantifizieren. So wurde gezeigt, dass die Transduktion von HTNCre durch fötales Kälberserum (FKS) stark inhibiert wird. Aus diesem Grund wurde ein serumreduziertes ES-Zellmedium entwickelt, mit dem die Transduktions- Inhibition unter Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung von ES-Zellen deutlich verringert werden konnte. Die Transduktions-Effizienz konnte ebenfalls durch den Einsatz des fusogenen Peptids dTAT-HA2 gesteigert werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Technik der Protein-Transduktion eine exakte Kontrolle über den Zeitpunkt und das Ausmaß der Cre-Aktivtät erlaubt, und sich auf diese Weise die in der Literatur vielfach beschriebenen Cre-induzierten Toxizitäten umgehen lassen. Nach der HTNCre-Behandlung von murinen ES-Zellen war weder das Proliferationsverhalten verändert, noch konnten chromosomale Veränderungen festgestellt werden. Die Keimbahngängigkeit der ES-Zellen blieb trotz der HTNCre-Behandlung erhalten.<br /> Analog zum Beispiel von Cre wurde eine membranpermeable Version der Flpe Rekombinase geschaffen, mit der gezeigt werden konnte, dass die Anwendbarkeit der Protein-Transduktion bei ES-Zellen nicht allein auf Cre beschränkt ist.<br /> Zur Herstellung einer zellmembrangängigen Version des Transkriptionsfaktors Nanog wurde unter mehreren klonierten Nanog-Varianten das rekombinante Fusionsprotein mit einer optimalen Kombination aus Reinheit und Löslichkeit identifiziert („Nanog-TAT“). Nanog- TAT induzierte bei murinen Wildtyp-ES-Zellen (C57BL/6) eine kompakte, weniger differenziertere Morphologie als unbehandelte Kontrollzellen und verstärkte die für ES-Zellen charakteristische Alkalische Phosphatase (AP) Aktivität, was ebenfalls auf eine Inhibition von Differenzierungsvorgängen hinweist. Nanog-TAT erhielt unter Entzug des für ES-Zellen sonst essentiellen Zytokins LIF (<em>leukemia inhibitory factor</em>) die Selbsterneuerung von ESZellen. Eine ES-Zelllinie, mit Reportertransgen unter Kontrolle von Promotorelementen des Pluripotenzmarkers Oct4, reagierte vergleichbar auf Nanog-TAT und wurde für bis zu 12 Passagen ohne LIF kultiviert. Der ES-Zellstatus dieser Zellen wurde mittels durchflusszytometrischer Analysen und Färbungen auf spezifische Pluripotenz-Marker analysiert. Die LIF-entzogenen Oct4-Reporter-ES-Zellen zeigten unter Nanog-TATBehandlung weiterhin GFP-Fluoreszenz und ließen sich positiv auf Oct4, SSEA-1 und AP färben. Ferner erhielt Nanog-TAT bei diesen Zellen das Potential in Embryoidkörperchen, Teratomen und chimären Tieren zu Geweben der drei Keimblätter differenzieren zu können. Des Weiteren konnte eine synergistische Wirkung von LIF und Nanog-TAT festgestellt werden. Diese manifestierte sich in einer erhöhten Proliferation, Klonierungseffizienz und Viabilität sowie einer homogeneren Fluoreszenz der Oct4-Reporter ES-Zellen. Der Effekt von Nanog-TAT ist unabhängig vom JAK/Stat3 Signalweg, wie durch die Selbsterneuerung Nanog-TAT-behandelter ES-Zellen in Anwesenheit eines JAK-Inhibitors gezeigt wurde. Eine direkte oder indirekte Phosphorylierung von Stat3 durch Nanog-TAT findet nicht statt. Es wurde weiter gezeigt, dass Nanog-TAT auch bei humanen ES-Zellen inhibierend auf die Differenzierung wirkt.<br /> Somit wurde im Rahmen dieser Arbeit ein System zum direkten Transfer biologisch aktiven Nanog-Proteins zur Anwendungsreife gebracht und eingehend funktionell charakterisiert. Mit dieser Technik lässt sich nun, unter Umgehung eines Gentransfers, die Rolle von Nanog in ES-Zellen weitergehend analysieren, sowie seine potentiell förderliche Aktivität bei der Pluripotenz-Induktion in somatischen Zellen untersuchen.