Untersuchungen zur Aktivität des Stammzellfaktors Nanog in embryonalen Stammzellen und somatischen Zellen

Abstract

Embryonale Stamm (ES)-Zellen besitzen im Gegensatz zu somatischen Zellen die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und in alle Zelltypen zu differenzieren. Die Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2 und Nanog bilden ein transkriptionelles Netzwerk, das diese ES-Zell-Identität determiniert. <br /> Um die Effekte von Nanog sowohl in ES-Zellen als auch in primären Fibroblasten und immortalisierten Zell-Linien zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei experimentelle Strategien verfolgt: a) in einem genetischem Ansatz wurde ein Vektorsystem zur konditionalen Überexpression kloniert, welches über Transfektion bzw. Supertransfektion eine Cre-Rekombinase-vermittelte Überexpression von Nanog ermöglicht. b) In einem Protein-biochemischen Ansatz wurden somatische Zellen mit rekombinanten zell-permeablem Nanog (Nanog-TAT) zeit- und dosisabhängig behandelt. <br /> Mit Hilfe des genetischen Ansatzes konnte bestätigt werden, dass die Überexpression von Nanog in ES-Zellen die Differenzierung in Abwesenheit von LIF inhibiert. In somatischen Zellen führte die Überexpression von Nanog zu toxischen Effekten.<br /> Die Anwendung des zell-permeablen Nanog-TAT Proteins zeigte, dass Nanog-TAT, aber nicht ein Kontrollprotein ohne Homeodomäne (NanogΔHD) bei NIH 3T3 Zellen einen transformierten Phänotyp verursacht, der durch erhöhte Proliferation und den Verlust der Kontaktinhibition charakterisiert ist. Dabei bildeten nur Nanog-TAT behandelte Zellen dreidimensionale Foci und in einem Soft-Agar Test führten Nanog-TAT-vorbehandelte Zellen zu deutlich mehr Kolonien als unbehandelte oder mit dem Kontrollprotein behandelte Zellen. Die Bildung der Foci war reversibel und abhängig von der Nanog-TAT Konzentration und Expositionsdauer, aber weitgehend unabhängig von der PI(3)Kinase Aktivität. Nach Injektion in SCID/beige Mäuse verursachten Nanog-TAT-vorbehandelte Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen vergrößerte Tumore. In primären Zellen wie murinen embryonalen Fibroblasten-Zellen (MEF-Zellen) induzierte Nanog-TAT eine deutlich erhöhte Proliferation und die für MEF-Zellen typische Seneszenz nach vier bis sieben Passagen konnte durch die Nanog-TAT-Behandlung inhibiert werden. Dabei zeigten die mit Nanog-TAT behandelten Zellen auch nach 100 Tagen in Kultur noch einen überwiegend normalen Karyotyp, während die Kontroll-Zellen ausschließlich hypotetraploid waren.