| dc.description.abstract | Die Hämophilie B ist eine Blutgerinnungsstörung, die aus einer Faktor IX-Defizienz resultiert. Die Gentherapie stellt eine interessante Alternative zur klassischen Therapie dar und hat in Tierversuchen bereits zu lang anhaltenden und teilweise extrem hohen Faktor IX-Expressionsspiegeln, die bei einem Vielfachen (2600 %) des normalen Levels lagen, geführt.
Eine relativ geringe Erhöhung des humanen Faktor IX-Spiegels um >29 % gegenüber dem Durchschnittswert erhöht das Risiko einer tiefen Beinvenenthrombose um das zwei- bis dreifache. Für zukünftige gentherapeutische Studien am Menschen ist es somit wichtig, Protokolle zu schaffen, die effizient und zuverlässig die Herunterregulierung zu hoher Expressionsraten ermöglichen, um die humane Faktor IX-Aktivität im therapeutischen Fenster zu halten. Aus diesem Grund wurde ein Vektorsystem entwickelt, das eine einfache und schnelle Regulation der Genexpression erlaubt.
Um die Regulation der humanen Faktor IX-Expression zu ermöglichen, wurde das Tet OFF-System in einem auf dem Adenoassoziierten Virus (AAV) basierendem Vektor eingesetzt. Hierfür waren zwei Expressionskassetten notwendig. Eine therapeutische Kassette, die das humane Faktor IX-Gen unter der Kontrolle eines TRE-Promotors enthielt und eine regulatorische, welche durch die Synthese eines Transaktivatorproteins die Expression des humanen Faktor IX-Gens initiierte. Um die Transgenexpression auf das Zielorgan zu beschränken, stand die regulatorische Expressionskassette unter der Kontrolle eines leberspezifischen Promotors (haat-Promotor, apoE.4x-Enhancer). Somit wurde das Transaktivatorprotein nur in den Leberzellen synthetisiert, band dort an den TRE-Promotor und bewirkte dadurch die humane Faktor IX-Produktion. Die Zugabe von Doxycyclin bewirkte eine Komplexbildung von Transaktivator und Doxycyclin, wodurch die Transaktivatorbindung an den TRE-Promotors verhindert und die humane Faktor IX-Expression eingestellt wurde.
Da eine hohe Dosis rekombinanter Viren den Organismus des Patienten belasten würde und zu unerwünschten Nebenwirkungen führen könnte, wurden beide Expressionskassetten zu einer einzigen, dualen Kassette kombiniert und in nur einen AAV-Vektor verpackt. Auf Grund der sehr begrenzten Kapazität von Vektoren auf AAV-Basis wurde als leberspezifischer Promotor eine Kombination eines kurzen haat-Promotors mit einer vierfachen Wiederholung der apoE-Enhancer-Sequenz verwendet.
Im Anschluss an die Konstruktion der dualen Expressionskassette wurde diese zwischen AAV2-ITRs kloniert und die rekombinanten Viren in einer Produktionszelllinie hergestellt. Nach Dichtegradienten-Zentrifugation, Aufreinigung und Konzentrierung der rekombinanten AAV mit einer anhand der Literatur etablierten Methode, wurden die Virusgenome mittels einer quantitativen real time-PCR quantifiziert und in vitro- sowie in vivo-Studien durchgeführt.
Die Expressionsstudien in vitro zeigten, dass die Transgenexpression nur leberspezifisch in HepG2-Zellen stattfand, nicht jedoch in einer anderen (HEK293-) Zelllinie. Durch Hinzufügen von Doxycyclin konnte die durch das rekombinante AAV vermittelte humane Faktor IX-Expression in HepG2-Zellen innerhalb von 48 Stunden auf ein Minimum reduziert werden. Die Infektion von immundefizienten SCID- und immunkompetenten C57BL/6-Mäusen führte zu einer durchschnittlich signifikant höheren Faktor IX-Aktivität, die jedoch geringer als erwartet ausfiel. Molekulargenetische Untersuchungen mittels quantitativer real time-PCR zeigten eine gute Lebertransduktionsrate sowie eine geringe bis kaum nachweisbare Streuung in andere untersuchte Organe und Gewebe. Auf mRNA-Ebene konnte mittels reverser Transkription und anschließender PCR die Transkription des regulatorischen tTA-Gens und des humanen Faktor IX-Gens nachgewiesen werden. Auf Grund der Ergebnisse kann vermutete werden, dass die Kombination des verkürzten haat-Promotors mit der vierfachen Wiederholung des apoE-Enhancers für die geringe humane Faktor IX-Aktivität im Blut Mäusen verantwortlich war. | |
