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Fingerlyophilisation als schnelles Gefriertrocknungsverfahren
Untersuchungen zum Aktivitätsverlust von β-Galactosidase und Trypsin als Modellproteine in Abhängigkeit von Einfrier- und Trocknungsbedingungen

dc.contributor.advisorSüverkrüp, Richard
dc.contributor.authorGrimm, Anna Maria
dc.date.accessioned2020-04-12T15:26:56Z
dc.date.available2020-04-12T15:26:56Z
dc.date.issued2008
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/20.500.11811/3632
dc.description.abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Gefriertrockner - der Fingerlyophilisator - auf seine Funktion im Hinblick auf die Verarbeitung von Proteinzubereitungen gestestet.
Als Modellproteine dienten β-Galactosidase und Trypsin. Anhand ihrer Aktivitätsänderung wurde ihre Empfindlichkeit auf das Einfrieren und die Gefriertrocknung untersucht.
Der Aktivitätsverlust der Enzyme nach den drei Einfrierverfahren: Einfrieren bei -27°C, bei -78°C und Schockeinfrieren, sowie nach konventioneller Gefriertrocknung und Fingerlyophilisation sollte ein Aufschluss darüber geben, welche Verfahrensart für die Enzymverarbeitung am besten geeignet ist. Bei der konventionellen Gefriertrocknung wurden drei Einfriermethoden angewandt: Einfrieren bei -27°C, -78°C und Schockeinfrieren. Bei der Fingerlyophilisation wurde ausschließlich das Schockeinfrieren eingesetzt.
Außerdem sollte das Ausmaß der protektiven Wirkung von Hypromellose und Mannitol auf die Modellenzyme bei den angewendeten Verfahren untersucht werden. Darüber hinaus wurden die Eigenschaften der Lyophilisate wie Oberflächenstruktur, kristallographische Struktur und der Restwassergehalt der Lyophilisate analysiert.
Es zeigte sich, dass β-Galactosidase erheblich empfindlicher auf das Einfrieren und die Gefriertrocknung reagierte als Trypsin. Nach dem Einfrieren lag die β-Galactosidaseaktivität im Mittel bei 60% und die von Trypsin bei 85%. Das Schockeinfrieren war für beide Enzyme das beste Einfrierverfahren, da ihre Aktivität danach fast vollständig erhalten blieb. β-Galactosidase wurde am meisten durch das Einfrieren bei -27°C geschädigt. Ihre Aktivität sank danach um ca. 36% gegenüber dem Mittelwert (60% vgl. Tabelle 4-10 S.106). Bei Trypsin sind keine deutlichen Unterschiede in der Restaktivität zwischen den drei Einfrierverfahren festgestellt worden.
Nach der konventionellen Gefriertrocknung ist die Restaktivität von β-Galactosidase und Trypsin höher als nach der Fingerlyophilisation. Die größte Differenz in der Restaktivitäten zwischen den beiden Gefriertrocknungsverfahren tritt in der β-Galactosidase-Lösung ohne Kryoprotektorzusatz auf (65%) (vgl. Abbildung 4-14, Kap. 4.1.4.1). Die Unterschiede in der Trypsinrestaktivität nach beiden Verfahren betragen lediglich zu 30%, in der Lösung mit 1% Hypromellose, zugunsten der konventionellen Gefriertrocknung (vgl. Abbildung 4-30, Kap.4.2.4.1).
Beim Einfrieren von β-Galactosidase erwies sich der Zusatz von 5% Mannitol und 1% Hypromellose als kryoprotektiv. Bei der Gefriertrocknung von β-Galactosidase zeigten 1% Hypromellose und 10% Mannitol einen positiven Effekt auf ihre Restaktivität. Beim Einfrieren von Trypsin dagegen zeigten 0,5% Hypromellose 5% und 10 % Mannitol eine Schutzwirkung und bei der konventionellen Gefriertrocknung 1% Hypromellose.
Die Analyse der Oberflächenstruktur ergab deutliche Unterschiede zwischen den Lyophilisaten mit Hypromellose und Mannitol. Gefriergetrocknete Hypromellose weist nach langsamem Einfrieren bei -27°C eine blätterteigartige Struktur auf. Nach Schockeinfrieren und Gefriertrocknung wird eine geschlossene Oberfläche mit runden Poren gebildet. Mannitol kristallisiert während des langsamen Einfriervorgangs (bei -27°C) aus. Im Lyophilisat erkennt man eine stern-bis fächerförmige scharfkantige Kristallstruktur. Nach Schockeinfrieren und Gefriertrocknen tritt eine „ebene“ Oberfläche mit kleinen Poren auf, die an Knochenspongiosa erinnert.
Die röntgendiffraktometrische Untersuchung zeigte, dass Hypromellose in den Lyophilisaten amorph vorliegt. Der Phosphat-Puffer und der Trispuffer fallen kristallin aus. Der Zusatz von Hypromellose setzt den kristallinen Anteil im Lyophilisat mit Phosphatpuffer herab. Mannitol kristallisiert je nach herrschenden Bedingungen in α-, β-oder δ-Modifikation aus. In den Lyophilisaten mit Wasser liegt nach dem Einfrieren bei -27°C vorwiegend die α-Form vor, nach dem Schockeinfrieren und dem Einfrieren bei -78°C dagegen die β-Modifikation. Der Zusatz des Phosphatpuffers vermindert den kristallinen Anteil in den Lyophilisaten mit Mannitol.
Der Restwassergehalt der Lyophilisate mit Mannitol ist bei beiden untersuchten Gefriertrocknungsverfahren niedriger als der der Hypromelloselyophilisate. Nach der Fingerlyophilisation liegt er zwischen 11-16% für Hypromelloselyophilisate und bei 3-5% für Mannitollyophilisate. Die konventionell gefriergetrocknete Hypromellose weist eine Restfeuchte von 5-6% auf und nach dem gleichen Verfahren getrocknetes Mannitol 2-3%.

en
dc.language.isodeu
dc.rightsIn Copyright
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subjectGefriertrocknung
dc.subjectLyophilisation
dc.subjectEnzyme
dc.subjectß-Galactosidase
dc.subjectTrypsin
dc.subject.ddc500 Naturwissenschaften
dc.subject.ddc610 Medizin, Gesundheit
dc.titleFingerlyophilisation als schnelles Gefriertrocknungsverfahren
dc.title.alternativeUntersuchungen zum Aktivitätsverlust von β-Galactosidase und Trypsin als Modellproteine in Abhängigkeit von Einfrier- und Trocknungsbedingungen
dc.typeDissertation oder Habilitation
dc.publisher.nameUniversitäts- und Landesbibliothek Bonn
dc.publisher.locationBonn
dc.rights.accessRightsopenAccess
dc.identifier.urnhttps://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-14581
ulbbn.pubtypeErstveröffentlichung
ulbbn.birthnameSkorupa
ulbbnediss.affiliation.nameRheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
ulbbnediss.affiliation.locationBonn
ulbbnediss.thesis.levelDissertation
ulbbnediss.dissID1458
ulbbnediss.date.accepted28.03.2008
ulbbnediss.fakultaetMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
dc.contributor.coRefereeSteffens, Klaus-Jürgen


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