Untersuchung der Protein/Substrat-Interaktion an rekombinantem P-Glykoprotein

Abstract

<p>Dem ATP-Binding-Cassette(ABC)-Transporter P-Glykoprotein (P-gp) kommt aufgrund seiner Rolle bei der so genannten Multridrug-Resistenz(MDR) von Tumoren eine große pharmazeutische Bedeutung zu. Dennoch konnte bis heute weder die breite Substratspezifität noch der Funktionsmechanismus des Transporters vollständig geklärt werden. Die vorliegende Arbeit setzt sich daher mit der Frage auseinander, wie rekombinantes P-gp bei der Untersuchung der Protein/Substrat-Interaktion helfen kann. <br /> Dazu wurden zunächst Ovarienzellen des chinesischen Hamsters mit humaner mdr1 cDNA transfiziert und die erhaltenen klonalen Zelllinien charakterisiert. Anschließend wurden mit Hilfe des Calcein-AM Transportassays funktionelle Daten für einen Testsatz von neun Substanzen an den transfizierten Zellen erhoben. Der Vergleich dieser Daten mit Daten, die an Zellen erhoben wurden, die den MDR-Phänotyp durch Selektion mit einem Zytostatikum entwickelten, ergab eine gute Korrelation der Ergebnisse. Auf diese Weise konnte sichergestellt werden, dass die unter Selektionsdruck entwickelte Resistenz der standardmäßig verwendeten Zelllinie einzig auf die Überexpression von P-gp zurückzuführen ist. Das zellbasierte Expressionssystem konnte somit die Validität bestehender Testsysteme untermauern.<br /> Im Anschluss wurde ein weiteres auf Saccharomyces cerevisiae basierendes Expressionssystem etabliert. Dieses ermöglichte die Gewinnung und Aufreinigung größerer Mengen humanen P-gps und die anschließende Rekonstitution des Transporters in einer chemisch definierten Lipidumgebung. <br /> Nach der erfolgreichen Etablierung des Systems wurden 28 ausgewählte Substanzen hinsichtlich ihrer Auswirkung auf die ATPase-Aktivität des Transporters untersucht. Durch den Vergleich dieser Versuchsergebnisse mit den Ergebnissen des bisher zur Charakterisierung der Protein/Substrat-Interaktion eingesetzten Calcein-AM Transportassays konnte gezeigt werden, dass beide Testsysteme zum Teil deutlich unterschiedliche Ergebnisse liefern. So beschreibt der Calcein-AM Transportassay die Fähigkeit einer Substanz die P-gp Funktion zu inhibieren. Diese Fähigkeit ist nicht allein von der Affinität der Substanz zum Transporter abhängig sondern auch von ihrer Diffusionsgeschwindigkeit durch die Zellmembran. Andererseits liefert der ATPase-Assay ein Maß für die Affinität einer Substanz zum Transporter. Die beiden Testsysteme zur funktionellen Untersuchung von P-gp ergänzen sich somit sinnvoll.<br /> Nachdem im ersten Teil der Nutzen von rekombinantem P-gp in funktionellen Untersuchungen gezeigt wurde, beschäftigte sich der zweite Teil dieser Arbeit mit Möglichkeiten zur genaueren Untersuchung der Substratbindungsstellen und dem Mechanismus der Bindung.<br /> Ein Ansatz war dabei die Etablierung eines Protokolls zur Durchführung von Radioligand-Bindungsexperimenten im Mikrotiterplattenformat. Als Ausgangspunkt dieser Experimente dienten P-gp-haltige Membranpräparationen aus den im ersten Teil der Arbeit hergestellten transfizierten Zellen. Vorläufige Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen zeigten dabei Übereinstimmungen mit Literaturdaten und Daten, die in dieser Arbeit mit dem ATPase-Assay erhoben wurden. Jedoch waren die Bindungskonstanten im Vergleich zur Literatur niedriger. Eine mögliche Ursache hierfür war der Zusatz von BSA zum Bindungspuffer zur Verhinderung der ausgeprägten Adsorption des Radioliganden [³H]Vinblastin an das Polypropylen-Arbeitsmaterial. Es sollte daher zukünftig nach Alternativen für BSA gesucht werden. Denkbar wäre auch die Verwendung eines anderen Radioliganden. Anbieten würde sich hier die Substanz XR9576 die in tritiierter Form den bis dato affinsten Radioliganden für P-gp darstellt, jedoch nicht kommerziell erhältlich ist.<br /> Schließlich wurde die Durchführbarkeit von Photoaffinitätsmarkierungen an aufgereinigtem P-gp zur Identifizierung der Lage der Bindungsstelle untersucht. Erste Versuche mit den Photoliganden H19 und WK-X-87 lieferten vielversprechende Ergebnisse. So konnte eine Bindungsregion identfiziert werden, die nachgewiesener Maßen Aminosäuren enthält, welche an der Substratbindung beteiligt sind. Photoaffinitätsmarkierungen an aufgereinigtem P-gp scheinen daher ein gangbarer Weg zur Identifizierung der Substratbindungstellen zu sein.<br /> Insgesamt konnte der Nutzen von rekombinantem P-Glykoprotein zur Untersuchung der Protein/Substrat-Interaktion nachgewiesen werden. So konnten die in dieser Arbeit verwendeten Expressionssysteme helfen, die Validität bestehender funktioneller Testsysteme weiter zu untermauern. Zusätzlich konnte mit den durchgeführten Radioligand-Bindungsexperimenten und den Photoaffinitätsmarkierungsexperimenten zwei vielversprechende Wege aufgezeigt werden, die in Zukunft die direkte Untersuchung des Bindungsmechanismus und der Substratbindungsstellen erlauben.</p>