Untersuchungen zur biologischen Funktion der „Processing“-α1,2-Mannosidase IA mittels „knock out“-Mäusen

Abstract

<p>Nach heutigen Kenntnissen existieren zwei ER- und drei Golgi-residente α1,2-Mannosidasen, die am „frühen“ Oligosaccharid-Processing von N-Glykoproteinen beteiligt sind. Im Gegensatz zu den beiden ER-Mannosidasen, die Glc(X)Man9GlcNAc2 zu spezifischen Man8lGlcNAc(X)Isomeren abbauen, hydrolysieren die drei Isoemzyme des Golgi (α1,2-Mannosidasen IA, IB und IC) alle α1,2-mannosidischen Bindungen in Man9-Man8GlcNAc2-Intermediaten unter Bildung von Man5GlcNAc2. <br /> Die zelluläre Bedeutung der verschiedenen α1,2-Mannosidasen ist in vielen Punkten noch unverstanden. Um die spezifische Funktion, der in unserem Arbeitskreis seit längerem untersuchten Golgi- α1,2-Mannosidase IA aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit eine „knock out“-Mauslinie hergestellt, bei der das α1,2-Mannosidase IA-Gen spezifisch ausgeschaltet war. Anschließend wurden die Auswirkungen dieses Gendefekts auf zell- und entwicklungsspezifische Prozesse in der Maus analysiert. <br /> Für die Herstellung der α1,2-Mannosidase IA-Nullmutante wurden molekular- und zellbiologische Standardtechniken verwendet. <br /> Die heterozygote und homozygot defiziente Mauslinie zeigte weder im juvenilen noch im adulten Stadium einen unmittelbar erkennbaren Phänotyp. Kreuzungsexperimente zeigten dann, dass die Man-/--Männchen normal fortpflanzungsfähig, aber die weiblichen Mannosidase IA-defizienten Mäuse infertil waren. Um den Effekt der Mannosidase IA-Defizienz näher einzugrenzen, wurden zunächst verschiedene Stadien des weiblichen Vaginalzyklus und der ovariellen Follikulogenese näher betrachtet. Hierbei konnten keine morphologischen Auffälligkeiten bzw. Unterschiede zwischen ManIA-/-- und gesunden Weibchen festgestellt werden. Untersuchungen mit postovulativen Eizellen, die aus homozygoten (ManIA-/-) Weibchen isoliert wurden, zeigten dann, dass die Man IA-/-_Eizellen nach 3-5 Stunden unter Kulturbedingungen wesentlich instabiler waren, als Eizellen aus Wildtyp-Weibchen. Wurden die postovulativen Oozyten unter Kulturbedingungen mit Spermien aus gesunden Männchen zusammengebracht war eine Zellteilung, wie sie bei Eizellen aus Wildtyp-Weibchen beobachtet weden konnte, bei den Man IA-/--Eizellen nicht nachweisbar. Es zeigte sich, dass die Spermien zwar an die ManIA-/--Eizellen andockten, aber offenbar nicht die Zona pellucida durchdringen konnten. Die Zona pellucida (ZP) ist essentiell für die Oogenese, Fertilisation und frühe Embryogenese und umgibt als extrazelluläre Matrix die Oozyte. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass offensichtlich im Bereich der Zona pellucida bestimmte N-Glykoproteinstrukturen durch den Verlust der Enzymaktivität nicht korrekt modifiziert werden können, so dass diese funktionell wirksam sind, d.h. dass die Zona pellucida-Matrix den Bereich darstellt an dem die Mannosidase IA eingreift.<br /> Insgesamt gesehen zeigen die beschriebene Ergebnisse, dass der Verlust der Mannosidase IA-Aktivität zwar nicht die Enstehung einer ZP-Matrix verhindert, aber dass durch den Eingriff in die Biosynthesesequenz der N-gebundenen Oligosaccharidstrukturen auf den ZP-Glykoproteinen im frühen Golgi (durch das Aussschalten des Mannosidase IA-Gens) die Funktionsfähigkeit der ZP-Matrix in erheblichen Maße beeinflusst wird bzw., dass keine voll funktionsfähige Zona pellucida gebildet werden kann.</p>