Molekulare Interaktion von alkylierenden, noradrenergen Neurotoxinen mit dem humanen Noradrenalintransporter

Abstract

<p>Der Noradrenalintransporter (NAT) in der Plasmamembran noradrenerger Neurone ist für die Wiederaufnahme des während der Neurotransmission in den synaptischen Spalt freigesetzten Noradrenalins (NA) verantwortlich. Viele klinisch bedeutsame Antidepressiva sowie Kokain sind Inhibitoren des NAT. Eine genaue Kenntnis der Struktur der Ligandbindungsstelle des Transporters liegt bis heute nicht vor. Für das genaue Verständnis seiner Funktionsweise sowie für die Entwicklung nebenwirkungsärmerer Antidepressiva, die möglichst selektiv mit dem NAT interagieren, ist die exakte Kenntnis seiner Bindungsstelle unerlässlich. Das Hauptziel der Arbeit war es Informationen über diese zu gewinnen. Hierzu wurden kovalent mit dem NAT interagierende Substanzen eingesetzt.<br /> Vorausgegangene Studien mit dem NAT-inhibierenden, Thiolgruppen-spezifischen Reagenz N-Ethylmaleimide (NEM) lieferten Hinweise, dass den Cysteinen des NAT evtl. eine funktionelle Bedeutung zukommt. Daher wurden die zehn Cysteine des humanen NAT (hNAT) einzeln durch gerichtete Mutagenese gegen Alanin ausgetauscht und die Mutanten funktionell charakterisiert. Im Fall der beiden inaktiven Cys/Ala-Mutanten C176A und C185A konnte ein Ausbleiben der Plasmamembranexpression nachgewiesen werden. Die beiden Cysteine innerhalb der zweiten extrazellulären Schleife (ES2) bilden wahrscheinlich ein essentielles Cystin. Der gemeinsame Austausch der übrigen acht reduzierten Cysteine gegen Alanin oder Serin hatte ebenfalls den Verlust der Plasmamembranexpression zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der NA-Aufnahme in transfizierte HEK293-Zellen durch mikromolare Konzentrationen NEM auf einer rasch eintretenden ATP-Depletion beruht. Hingegen war die weniger NEM-empfindliche Nisoxetin-Bindung durch NAT-Substrate und -Inhibitoren vor einer irreversiblen Hemmung protektierbar, was auf eine kovalente Interaktion von NEM innerhalb der Ligandbindungstasche des NAT hindeutete. Doch mittels der Cys/Ala-Mutanten konnte die Alkylierung eines Cysteins als Ursache der Hemmung ausgeschlossen werden. Stattdessen wurde Histidin 222 innerhalb der ES2 als ein Interaktionspartner von NEM identifiziert. Insgesamt wurden alle 13 Histidine des hNAT einzeln gegen Alanin mutiert und die Mutanten funktionell charakterisiert.<br /> Zu einer direkten Markierung der Ligandbindungsstelle des NAT eignet sich das Haloalkylamin DSP4. Dieses selektive, noradrenerge Neurotoxin ist ein Substrat des NAT. Nach Zyklisierung zu einem Aziridiniumion bewirkt es durch die Alkylierung einer nukleophilen Aminosäure innerhalb der Ligandbindungsstelle eine irreversible Inhibition des Transporters, wie Auswasch- und Protektionsexperimente belegten. Es konnte gezeigt werden, dass DSP4 neben dem NAT auch eine irreversible Inhibition des Dopamintransporters und des Serotonintransporters bewirkt. Die alkylierte Aminosäure ist also bei den neuronalen Monoamintransportern (MATs) konserviert. Die Inhibition der extraneuronalen MATs, d.h. der Organischen Kationentransporter (OCT1, OCT2, OCT3) war hingegen reversibel. Nur NAT-exprimierende Zellen zeigten eine hohe Sensitivität gegen die zytotoxischen Effekte von DSP4. Es wurden alle nukleophilen Aminosäuren des hNAT, die potentielle Bindungspartner von DSP4 darstellten (Cystein, Histidin, Aspartat und Glutamat), gegen inerte Aminosäuren ausgetauscht und die Varianten bezüglich einer irreversiblen Hemmung getestet. Auf diese Weise ließ sich die durch DSP4 alkylierte Aminosäure auf das funktionell essentielle Aspartat 75 eingrenzen, welches selbst nicht ohne Funktionsverlust des Transporters ausgetauscht werden konnte. Nach aktuellen Modellvorstellungen ist dieses Aspartat für die Substratbindung in der Ligandbindungstasche der neuronalen MATs verantwortlich. Als affinitätsbestimmend für DSP4 konnte mittels NAT/DAT-Chimären der Bereich von TM6 - TM8 ermittelt werden.<br /> Schließlich konnte ein neuartiges 16-BAC/SDS-Elektrophoreseverfahren etabliert werden, das erstmals eine 2D-gelelektrophoretische Auftrennung von Membranproteinen mittels kationisch rehydratisierter Gelstreifen ermöglicht. Die neue Methode erwies sich als hoch reproduzierbar, leichter handhabbar und effizienter als herkömmliche Techniken, wie anhand einer Membranproteom-Analyse von HEK293-Zellen demonstriert werden konnte. Mit Hilfe dieses Verfahren war es nun erstmals möglich das hNAT-Protein über ein 2D-Acrylamidgel aus Plasmamembranen transfizierter HEK293-Zellen aufzutrennen.</p>